劉 丹，尹 東，曾 姝，何 明

(1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，2.江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006)

四甲基吡嗪(TMPZ)又名川芎嗪，是從川芎的生物堿中分離得到的有效單體。川芎嗪有良好的心肌保護(hù)作用，主要與其具備抗鈣與抗自由基雙重作用有關(guān)［1－2］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為革蘭陰性細(xì)菌胞壁的重要成分，是引起炎癥反應(yīng)和休克的關(guān)鍵介質(zhì)之一，常引起全身炎癥反應(yīng)并可導(dǎo)致多器官功能衰竭，累及心臟。有研究報(bào)道［3］，LPS可增加心肌細(xì)胞NADH氧化酶的表達(dá)及過(guò)氧化物增殖而導(dǎo)致心肌損傷。鑒于川芎嗪的抗氧自由基作用，我們假設(shè)川芎嗪可以保護(hù)LPS損傷的心肌細(xì)胞，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，觀(guān)察川芎嗪對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響，并檢測(cè)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)及NF-κB p65的核移位情況，探討川芎嗪對(duì)抗LPS損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 受試藥品與主要試劑 TMPZ:中國(guó)藥品生物制品檢定所，NF-κB p65、β-actin抗體及相應(yīng)二抗:Santa Cruz;DCHF-DA:Molecular probes;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;MDA、SOD、GSH-Px檢測(cè)試劑盒:南京建成生物工程研究所;胞核-胞質(zhì)蛋白制備試劑盒:北京普利萊基因技術(shù)有限公司;MEM培養(yǎng)基:Gibco BRL;LPS(傷寒菌內(nèi)毒素脂多糖)、胰酶、HEPES、MTT、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光印跡試劑、硝酸纖維素膜(Amersham，UK)、丙烯酰胺、PMSF、亮肽素、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、EDTA和DTT:Sigma公司;其它試劑均為分析純。

1.2 心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 參照以前的實(shí)驗(yàn)方法［4］，以出生1～3 d的SD乳鼠心室肌組織為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，0.1%胰酶消化分離，MEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清)混懸后放CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)孵育2 h去除成纖維細(xì)胞，然后分別按5×105cells·well－1、1 ×105cells·well－1接種于 6 孔、96 孔培養(yǎng)板，隔天換培養(yǎng)液，前3 d加入0.1 mmol·L－1Brdu抑制纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)4 d隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物處理 用不同劑量的TMPZ預(yù)處理3 h，棄原培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，換新的MEM培養(yǎng)基，再加LPS(5mg·L－1)繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)均分溶劑對(duì)照組(正常對(duì)照)、LPS處理組及藥物干預(yù)組(TMPZ+LPS)，每組至少重復(fù)6次，TMPZ用生理鹽水溶解。

1.4 細(xì)胞存活率 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。胰酶消化收集細(xì)胞，每組細(xì)胞以1×104cells·well－1濃度接種至96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞融合至80%左右開(kāi)始檢測(cè)。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT 溶液(5 g·L－1溶于PBS)，37 ℃，4 h，然后每孔加DMSO 150 μl振蕩10 min，使藍(lán)色結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值(OD值)。

1.5 生化檢測(cè) 各組處理結(jié)束后取上清200 μl，生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)LDH活性。

1.6 流式細(xì)胞法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2～3次，加入0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA)消化細(xì)胞后收集，將配制好的 10 μmol·L－1DCFH-DA 溶液 500 μl重懸細(xì)胞，37℃孵育30 min，離心，800 ×g，5 min，棄上清，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2～3次，制成1×108cells·L－1的懸液，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以488 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，530 nm為發(fā)射波長(zhǎng)。以不加DCFH-DA的一管為陰性對(duì)照。

1.7 細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量、SOD及GSH-Px活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，消化收集心肌細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8 Western blot檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取心肌細(xì)胞核蛋白，同等量蛋白質(zhì)行SDSPAGE后，電轉(zhuǎn)膜，分別結(jié)合一抗、二抗，最后X線(xiàn)膠片曝光分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件行組間方差分析，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 TMPZ對(duì)LPS致心肌細(xì)胞損傷的影響 如Fig 1，2 所示，心肌細(xì)胞用不同劑量(40、80、120 μmol·L－1)TMPZ 預(yù)處理 3 h，加入 10 mg·L－1LPS，心肌細(xì)胞的存活率隨TMPZ劑量的增大而升高，LDH值則隨TMPZ劑量的增大而減少，具有明顯的劑量依賴(lài)性。

Fig 1 Effects of TMPZ on viability of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

Fig 2 Effects of TMPZ on LDH activity of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

2.2 TMPZ劑量依賴(lài)性地減少ROS生成 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 3)，用10 mg·L－1LPS處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，ROS生成明顯增加(與對(duì)照組比，P ＜0.01)，用40 ～120 μmol·L－1TMPZ 預(yù)處理心肌細(xì)胞3 h，從 40 μmol·L－1TMPZ 開(kāi)始，ROS 生成明顯降低(與LPS處理組相比，P＜0.01)。說(shuō)明隨著藥物濃度的增加，ROS的生成逐漸減少。

2.3 TMPZ劑量依賴(lài)性地抑制NF-κB p65核移位

Western blot結(jié)果顯示(Fig 4)，用10 mg·L－1LPS處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，核蛋白中NF-κB p65蛋白含量明顯增加(與對(duì)照組比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L－1TMPZ 預(yù)處理心肌細(xì)胞3 h，從40 μmol·L－1TMPZ開(kāi)始，核蛋白中NF-κB p65蛋白含量明顯降低(與LPS處理組相比，P＜0.01)。說(shuō)明隨著藥物濃度的增加，抑制NF-κB p65蛋白向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。

2.4 TMPZ劑量依賴(lài)性地抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，提高抗氧化酶活性 如Fig 5所示，用10 mg·L－1LPS處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，MDA含量明顯增加，SOD及GSH-Px活性下降(與對(duì)照組比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L－1TMPZ 預(yù)處理心肌細(xì)胞 3 h，從 40 μmol·L－1TMPZ開(kāi)始，MDA 含量開(kāi)始下降，SOD 及GSH-Px活性增加(與LPS處理組相比，P＜0.01)。說(shuō)明隨著藥物濃度的增加，脂質(zhì)過(guò)氧化被抑制，抗氧化酶活性增加。

3 討論

LPS是革蘭陰性細(xì)菌致病的主要因素，它可引起機(jī)體的一系列炎癥反應(yīng)，是一種重要的致炎因子［5］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告［3，6］，LPS可增加心肌細(xì)胞NADH氧化酶的表達(dá)及過(guò)氧化物增殖，造成ROS生成增加。ROS具有較高的反應(yīng)活性，正常情況下，細(xì)胞存在抗氧化酶類(lèi)，包括SOD、GSH-Px等，能夠清除細(xì)胞代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生的ROS，使得細(xì)胞內(nèi)ROS的生成與清除處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。但當(dāng)其生成較多，超過(guò)細(xì)胞抗氧化酶類(lèi)的清除水平時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞的廣泛損傷，如膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)及核酸損傷等。因此，刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的ROS可能是LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。我們的研究證實(shí)，LPS處理心肌細(xì)胞后，會(huì)使得MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性下降，ROS含量增加，心肌細(xì)胞存活率減少。

Fig 3Effects of TMPZ on ROS production of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6).

Fig 4 Effects of TMPZ on nuclear NF-κB p65 protein of cardiac cells subjected to LPS-induced injury by Western blot(±s，n=6)

TMPZ是中藥川芎的主要有效成份之一，許多研究［7－8］均報(bào)道川芎嗪有心血管保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用與其抗氧化作用有關(guān)。我們?cè)贚PS損傷心肌細(xì)胞之前給予不同劑量的TMPZ預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)有明顯的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用呈劑量依賴(lài)性;進(jìn)一步對(duì)TMPZ抗LPS損傷的機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與抑制 NF-κB 激活有關(guān)。眾所周知［9］，NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路被認(rèn)為是LPS所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中最重要的下游通路。一般情況下，NF-κB為p50/p65異源二聚體，與抑制物IκBα結(jié)合成無(wú)活性的三聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中;一旦受到外界因素刺激時(shí)，如大量產(chǎn)生的 ROS，IκBα 磷酸化而迅速降解，NF-κB即被激活，p65由細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核，從而調(diào)控一系列基因表達(dá)［10］。在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中，NF-κB的激活很有可能引起大量炎癥因子如TNF-α、IL-1等的過(guò)度表達(dá)，從而造成細(xì)胞損傷。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS能促進(jìn)p65的核移位，使p65在核中的表達(dá)明顯升高，而TMPZ則呈劑量依賴(lài)性抑制p65的核移位，從而起到對(duì)抗LPS致心肌細(xì)胞損傷的作用。因此，可以推斷川芎嗪對(duì)LPS所致的心肌損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制主要是通過(guò)減少ROS生成，從而抑制NF-κB的活化，阻止p65的核移位，減少炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

Fig 5 Effects of TMPZ on content of MDA，SOD and GSH-Px activities of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)

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