黎 榮，梁 韜，林 興，張士軍，蔣偉哲，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021)

弱視對(duì)兒童視力影響很大，若不采取及時(shí)的治療將會(huì)導(dǎo)致終身視力缺陷。國(guó)外研究表明神經(jīng)生長(zhǎng)因子在具有調(diào)節(jié)視覺發(fā)育可塑性的作用［2-3］。即刻早期基因c-fos的表達(dá)產(chǎn)物FOS蛋白同樣參與了視皮層相關(guān)區(qū)域神經(jīng)元功能活動(dòng)的調(diào)控，從而與視覺發(fā)育的可塑性密切相關(guān)［4-5］。目前國(guó)外臨床上多采用左旋多巴治療弱視，文獻(xiàn)報(bào)道其已取得了一定效果［6-7］。而新合成的化學(xué)物質(zhì)左旋多巴甲酯(LDME)將應(yīng)用于弱視治療研究。

本研究采用TUNEL檢測(cè)法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)觀察左旋多巴甲酯(LDME)對(duì)剝奪性弱視貓視皮層17區(qū)中細(xì)胞凋亡情況以及NGF、FOS陽性神經(jīng)元的形態(tài)變化和數(shù)量分布的影響，探討左旋多巴甲酯對(duì)弱視神經(jīng)細(xì)胞的影響及治療效果，從而為弱視的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 包埋機(jī):Japan Sakura finetechnical Co.Ltd，4590 Model;低溫高速離心機(jī):德國(guó)西門子公司Gel doc 2000;病理組織切片機(jī):Germany Leitz，2235 Model;病理圖像分析儀:Germany Leica Co.Ltd，DMR+550 Model。

1.2 主要試劑 NGF-β蛋白抗體:武漢博士德公司，批號(hào):3574102;FOS蛋白抗體:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào):27261;DAB顯色試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào):673767A;TUNEL檢測(cè)試劑盒:德國(guó) Roche公司，批號(hào):110684817910;二抗:上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，中國(guó);麻醉劑:體積分?jǐn)?shù)為0.25烏拉坦;灌注液:NS;4℃體積分?jǐn)?shù)為0.04多聚甲醛;緩沖液:30 g·L-1，檸檬酸，2 × SSC，0.5 mol·L-1PBS;5 g·L-1多聚賴氨酸。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 初生家養(yǎng)幼齡貓(2周齡)30只，體質(zhì)量約300～320 g，♀♂不分，常規(guī)檢查雙眼無異常。隨機(jī)分為6組(每組5只):左旋多巴甲酯高劑量組(LDMEH)、中劑量組(LDMEM)、低劑量組(LDMEL)、陽性對(duì)照組(PC)正常組(NC)、模型組(MC)。除正常組之外，于 4周齡時(shí)參照Hubel［1］經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法對(duì)各組幼貓進(jìn)行的左眼上下瞼縫合建立剝奪性弱視模型，在12周后打開縫合眼并開始結(jié)藥。每天灌胃左旋多巴甲酯20，40，80 mg·kg-1，陽性組為左旋多巴 40 mg·kg-1，正常組與模型組為等劑量生理鹽水，每天1次，持續(xù)30 d。動(dòng)物飼養(yǎng)在符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求的條件中。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的取材 在給藥后d 31時(shí)，腹腔注射適量的體積分?jǐn)?shù)為0.25烏拉坦進(jìn)行深度麻醉，將插管插入左心室后切開右心房形成出路，與此同時(shí)用動(dòng)脈夾夾住下腔靜脈血管，此做法有利于增加清洗腦的灌注流量，接著先快速灌注4℃生理鹽水250 ml，再灌注體積分?jǐn)?shù)為0.04多聚甲醛500 ml。打開頭顱取腦，根據(jù)Snider貓立體定向圖譜，分離出對(duì)應(yīng)的視皮層17區(qū)，浸入體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛液中后固定6 h，經(jīng)常規(guī)逐級(jí)脫水，二甲苯透明后，浸蠟包埋，切片厚度為6 μm，以上標(biāo)本全部置于適當(dāng)?shù)谋４?，然后進(jìn)行Nissl染色、TUNEL檢測(cè)以及NGF、FOS免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。所有染色過程均按照廠家試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為免疫陽性細(xì)胞。每張切片在視皮質(zhì)Ⅱ/Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ層分別隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)等長(zhǎng)度的視野進(jìn)行計(jì)算機(jī)顯微圖像分析，計(jì)算每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞表達(dá)計(jì)數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值后換算成陽性細(xì)胞的密度。采用SPSS13.0軟件，對(duì)各組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)差異的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)以及各組間免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Nissl染色光鏡觀察結(jié)果 經(jīng)Nissl染色后的視皮層神經(jīng)元的Nissl小體呈深藍(lán)色，細(xì)胞核淡藍(lán)色。低倍鏡下，正常幼貓視皮層的Nissl染色標(biāo)本上可以區(qū)分為4層:分子層(Ⅰ)、外層(Ⅱ/Ⅲ)、顆粒層(Ⅳ)及內(nèi)層(Ⅴ/Ⅵ )，相應(yīng)層細(xì)胞排列規(guī)則，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和染色正常。Nissl染色在于顯示視皮層的基本神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并可作為免疫組織化學(xué)分層計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)。見Fig 1。

Fig 1 Structural feature in the visual cortex area 17 in the cats of normal and model control groups(Nissl staining，×400)

2.2 左旋多巴甲酯對(duì)剝奪性弱視貓左側(cè)視皮層17區(qū)中細(xì)胞凋亡的影響 在光鏡下觀察到TUNEL陽性細(xì)胞呈棕褐色，給藥組視皮層在相同時(shí)期內(nèi)表現(xiàn)出不同劑量下的治療效價(jià)。與模型對(duì)照組比較，給藥各組的視皮層17區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量均有不同程度的減少。其中LDMEH表現(xiàn)出明顯的抗凋亡的效果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。給藥各組都對(duì)左側(cè)視皮質(zhì)17區(qū)神經(jīng)細(xì)胞有著一定程度的抑制凋亡作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。見 Tab 1、Fig 2。

Tab 1 Density of TUNEL positive cells in layers and divisions of the left 17 area of visual cortex in normal and monocular deprivation cats(±s，n=5，cell·mm-2)

Tab 1 Density of TUNEL positive cells in layers and divisions of the left 17 area of visual cortex in normal and monocular deprivation cats(±s，n=5，cell·mm-2)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05，##P＜0.01 vs MC.(One-Way ANOVA，LSD-t test)

Group Ⅱ/Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ0.000 0.000 0.001 0.001 NC 22±5 18±4 25±7 12±2 MC 236±42＊＊ 190±28＊＊ 278±34* 163±26*PC 64±19# 58±16# 55±11# 46±17#LDMEL 104±30# 91±22 124±33 78±19#LDMEM 59±23# 45±14## 41±16## 39±15#LDMEH 31±8## 23±11## 28±13## 20±6##F 35.673 38.405 39.795 34.763 P

2.3 左旋多巴甲酯對(duì)剝奪性弱視貓左側(cè)視皮層17區(qū)NGF的影響 光鏡下觀察到胞質(zhì)呈棕褐色為陽性細(xì)胞，各組剝奪側(cè)視皮層17區(qū)中NGF陽性細(xì)胞的分布基本相同，表現(xiàn)為計(jì)數(shù)細(xì)胞密度(ND)的不同。與模型對(duì)照組比較，LDME給藥組NGF免疫陽性細(xì)胞數(shù)量在各層有所增加，層間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。與陽性對(duì)照組比較，同劑量給藥的LDMEM陽性細(xì)胞數(shù)多于左旋多巴陽性組，提示LDMEM發(fā)揮了較好治療作用，但LDMEM低于LDMEH或正常對(duì)照組，差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見 Tab 2、Fig 3。

2.4 左旋多巴甲酯對(duì)剝奪性弱視左側(cè)貓視皮層17區(qū)FOS蛋白的影響 光鏡下觀察到正常幼貓視皮層17區(qū)中的FOS陽性細(xì)胞為淡棕黃色。模型對(duì)照組視皮層17區(qū)中FOS陽性細(xì)胞表達(dá)較少，較正常組其數(shù)量明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。其中LDMEH陽性細(xì)胞數(shù)量高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但與正常對(duì)照組比較，LDMEH的FOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)量在各層均少于正常組對(duì)照組，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示它們之間有一定的量效關(guān)系。見Tab 3、Fig 4。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，視覺發(fā)育敏感期內(nèi)的可塑性與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子間有密切聯(lián)系，其中的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，在視覺發(fā)育的可塑性方面有著重要作用［8-9］。

Tab 2Density of expression of NGF positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

Tab 2Density of expression of NGF positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05，##P＜0.01 vs MC

Group Ⅱ/Ⅲ Ⅳ Ⅴ ⅥNC 418.45±62.38 532.56±48.22 335.87±41.68 423.57±35.61 MC 147.57±45.13＊＊ 185.47±28.63＊＊ 105.78±26.75* 153.24±47.65*PC 246.89±46.74# 348.19±35.28# 181.56±42.53# 232.89±43.76#LDMEL 218.16±42.29# 305.37±34.48# 143.24±51.87 220.28±41.52 LDMEM 252.24±47.35# 350.21±39.86## 208.57±32.45## 245.57±43.37##LDMEH 389.46±45.68## 512.43±36.55## 331.41±28.65## 398.42±35.41#

Tab 3 Density of expression of FOS positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

Tab 3 Density of expression of FOS positive cells in layers of the left 17 area of visual cortex(±s，n=5，cell·mm-2)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs MC

Group Ⅱ/Ⅲ Ⅳ Ⅴ ⅥNC 381.44±41.47 369.44±43.36 285.66±39.58 317.67±36.52 MC 138.78±38.99＊＊ 119.67±25.03＊＊ 84.78±12.76* 98.11±17.46*PC 215.87±36.32# 208.89±36.74# 112.65±41.52# 159.89±23.87#LDMEL 207.31±24.37 198.02±30.26# 98.25±20.87 135.26±21.32 LDMEM 226.89±38.97## 214.26±48.35# 121.46±24.57## 167.68±24.25##LDMEH 357.58±35.46## 325.43±46.65## 268.43±26.65## 296.32±35.34##

Fig 2 Apoptosis index in the visual cortex area 17 (TUNEL staining，×100)

在細(xì)胞水平上，經(jīng)左旋多巴和左旋多巴甲酯治療后，弱視視皮層17區(qū)神經(jīng)細(xì)胞愈合恢復(fù)正常，表現(xiàn)為Nissl小體數(shù)量增加，說明了左旋多巴甲酯能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。在基因水平上，TUNEL法檢測(cè)準(zhǔn)確反映了弱視發(fā)生后視皮層17區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡時(shí)斷裂DNA的形態(tài)和生化特征，而在藥物治療后能夠有效減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，表現(xiàn)為抗細(xì)胞凋亡作用。實(shí)驗(yàn)表明在相等或較大的劑量下，左旋多巴甲酯的治療效果高于左旋多巴，其原因?yàn)樽笮喟图柞ブ苄詢?yōu)于左旋多巴，在相同條件下能更多通過血腦屏障，提高腦內(nèi)dopamine濃度。在視皮層17區(qū)中存在著多巴胺通路，它可直接參與關(guān)鍵期視皮層的發(fā)育，也可介導(dǎo)調(diào)節(jié)某些關(guān)鍵因子的活性，使發(fā)生早期類凋亡的視皮層神經(jīng)元得到恢復(fù)或重塑［10-11］。所以推測(cè):給予左旋多巴甲酯治療后，弱視眼視皮層l7區(qū)中神經(jīng)細(xì)胞由于dopamine濃度的補(bǔ)足解除了在“廢用”狀態(tài)中NGF的活性，促使其自身合成和釋放，進(jìn)而參與相關(guān)的蛋白酶及基因表達(dá)調(diào)控，恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的可塑性。

Fig 3 NGF expression in visual cortex area 17(immunohistochemical staining，×400)

Fig 4 FOS expression in visual cortex area 17(immunohistochemical staining，×400)

同樣，有研究認(rèn)為c-fos基因的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞的可塑性相關(guān)，而不僅僅將其表達(dá)情況視為神經(jīng)興奮性活動(dòng)水平［12-13］。c-fos基因產(chǎn)物FOS蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，和Jun家族的產(chǎn)物結(jié)合形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子，該活性因子與相關(guān)DNA序列結(jié)合作為大多數(shù)基因的啟動(dòng)子，實(shí)行對(duì)其它基因的調(diào)控后進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的重塑［14］。故推測(cè):給予左旋多巴甲酯后弱視眼視皮層l7區(qū)相應(yīng)區(qū)域的dopamine含量增多，dopamine直接介導(dǎo)調(diào)節(jié)N-甲基-天冬氨酸(NMDA)受體的活性，誘導(dǎo)c-fos基因表達(dá)，F(xiàn)OS蛋白合成增加后參與該區(qū)的生化調(diào)控，從而提高神經(jīng)細(xì)胞興奮性和降低其功能閾，恢復(fù)視覺功能。

綜上所述，在一定范圍內(nèi)剝奪性弱視貓接受左旋多巴甲酯治療后，發(fā)揮著抗細(xì)胞凋亡作用以及重塑了弱視發(fā)生后的神經(jīng)細(xì)胞，故左旋多巴甲酯可作為潛在的治療弱視藥物，本研究為其今后臨床應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)理論。

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