高 茜，管 瑩，米其利，李雪梅，繆明明，夭建華

(云南煙草科學(xué)研究院,云南 昆明 650106)

中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell，CHO cell)因其生長快、易培養(yǎng)等特性，被廣泛應(yīng)用于生物工程和多種化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)評價[1～3]。對于CHO工程細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)而言，細(xì)胞密度與存活率是影響細(xì)胞生長和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的重要因素之一[4，5]；而在毒理學(xué)評價實(shí)驗(yàn)如中性紅細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，接種的細(xì)胞密度對實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果也有較大的影響[6]。因此，在大規(guī)模的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中需要快速準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞存活率計(jì)算。

傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)板法易受操作細(xì)節(jié)影響，精確性得不到保證，并且費(fèi)時費(fèi)力。流式細(xì)胞儀法由于具有快速定量的特點(diǎn)，近年來在多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如細(xì)胞周期測定、細(xì)胞凋亡檢測、細(xì)胞分選中都得到應(yīng)用，但流式細(xì)胞儀在細(xì)胞計(jì)數(shù)方面的應(yīng)用主要是定性地分辨血液細(xì)胞中不同標(biāo)記的細(xì)胞比例[7，8]，而對CHO工程細(xì)胞的定量細(xì)胞計(jì)數(shù)卻未見報道。作者在此應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率計(jì)算，以期為CHO細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)及化學(xué)品的毒理學(xué)評價提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

中國倉鼠卵巢細(xì)胞，中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS、胎牛血清，美國Giboco公司；胰蛋白酶，美國Invitrogen公司；PI(碘化丙啶染色劑)，美國Sigma公司；臺盼藍(lán)，上海索來寶公司。

流式細(xì)胞儀(Cell Lab Quanta SC High Resolution Flow Cytometry)、流式管，Beckman Coulter公司；CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司；二級生物安全柜，Heal Force公司；TS100-F-HMC型倒置顯微鏡，Nikon公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國Corning公司；XS204型分析天平(感量0.0001 g)，Mettler Toledo公司；DT5-5型離心機(jī)，北京時代北利離心機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

在37 ℃水浴中復(fù)蘇CHO細(xì)胞，之后接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)在5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%，用胰蛋白酶消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌并離心后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。部分細(xì)胞用70%乙醇固定30 min，再用PBS洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞存活率計(jì)算

用移液槍將500 μL細(xì)胞懸液移至流式管中，加入5 μL 1 mg·mL-1PI，輕輕吹打均勻后避光染色5～10 min，放入流式細(xì)胞儀進(jìn)樣位置。打開流式細(xì)胞儀，第一次計(jì)數(shù)時選擇Counting程序，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)電子體積(EV)及側(cè)向散射光(SS)的值使細(xì)胞群位于合適的位置，并分別調(diào)節(jié)EV圖及SS圖中Counting的范圍去除碎片干擾，再根據(jù)PI的熒光強(qiáng)度(FL3)設(shè)定死活細(xì)胞范圍，并保存程序?yàn)镃HO cell counting。以后計(jì)數(shù)時選擇CHO cell counting程序來讀取數(shù)據(jù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)為SS圖的統(tǒng)計(jì)值，細(xì)胞存活率為FL3圖的統(tǒng)計(jì)值。

1.2.3 應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞存活率計(jì)算

將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。用移液槍將50 μL細(xì)胞懸液移至離心管中，加入50 μL 0.1%臺盼藍(lán)染液，染色3 min后將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入。將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的4個大格(每個大格含有16個中格)中的細(xì)胞數(shù)及被染液染上色的細(xì)胞數(shù)。按下式計(jì)算細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度及細(xì)胞存活率：

2 結(jié)果與討論

2.1 建立流式細(xì)胞儀進(jìn)行CHO細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞存活率計(jì)算的方法

流式細(xì)胞儀是根據(jù)EV和SS2個參數(shù)來識別CHO細(xì)胞的，由于不同細(xì)胞的大小和性質(zhì)不同，要根據(jù)不同的細(xì)胞調(diào)整EV與SS的Gain值以使細(xì)胞易于分析。設(shè)置EV=0.16、SS=3.6，CHO細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測后得到的流式散點(diǎn)圖如圖1所示。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測CHO細(xì)胞散點(diǎn)圖(SS/EV)

由圖1可以看出，消化的CHO細(xì)胞分散狀況良好，大部分都是單細(xì)胞狀態(tài)。

由于細(xì)胞在消化處理的過程中會受到一定的損傷，并且存在一些未消化完全的細(xì)胞團(tuán)，為了排除這些因素的影響，分別設(shè)定SS及EV2個參數(shù)的范圍以更精確地進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過SS參數(shù)和EV參數(shù)去除細(xì)胞碎片、細(xì)胞團(tuán)及細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)的直方圖見圖2。

圖2 CHO單細(xì)胞范圍直方圖

PI(碘化丙啶)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但能夠透過死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，在488 nm激發(fā)光下使細(xì)胞核紅染[9]。因此，可用PI作為計(jì)算細(xì)胞存活率的染料，熒光強(qiáng)度低的為活細(xì)胞，熒光強(qiáng)度高的為死細(xì)胞。CHO細(xì)胞的PI著色直方圖見圖3。

圖3 未處理(a)和70%乙醇處理(b)CHO細(xì)胞的PI著色直方圖

由圖3可以看出，未處理CHO細(xì)胞的PI著色圖的峰值范圍主要在100～102熒光范圍內(nèi)；70%乙醇處理后的CHO細(xì)胞的PI著色圖的峰值范圍主要在103～104熒光范圍內(nèi)。因此，可根據(jù)這兩個區(qū)域分別劃定活細(xì)胞及死細(xì)胞的范圍從而計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2 兩種方法細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較

用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板分別對CHO細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每種計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)3次并計(jì)算均值與SD值，結(jié)果見表1。

表1 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞濃度

由表1可看出，流式細(xì)胞儀法計(jì)算結(jié)果與CHO細(xì)胞稀釋梯度一致，并且SD值較低，重復(fù)性好；血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算結(jié)果雖然也有一定的梯度，但與細(xì)胞稀釋梯度并不完全吻合，SD值也較高，計(jì)算結(jié)果重復(fù)性較差，需要多次計(jì)數(shù)才能獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果。

為了進(jìn)一步研究流式細(xì)胞儀法是否能替代血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行細(xì)胞濃度計(jì)算，對兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞濃度相關(guān)性分析

由圖4可以看出，兩種方法的相關(guān)系數(shù)R2=0.9341，表明相關(guān)性較好。

2.3 兩種方法細(xì)胞存活率計(jì)算結(jié)果比較

用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板分別對CHO細(xì)胞進(jìn)行存活率計(jì)算，每種方法計(jì)算3次并計(jì)算均值與SD值，結(jié)果見表2。

表2 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞存活率

由表2可以看出，流式細(xì)胞儀法計(jì)算的存活率結(jié)果與CHO細(xì)胞處理方式一致，并且SD值較低，重復(fù)性好；血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算結(jié)果雖然也與CHO細(xì)胞處理方式基本吻合，但SD值較高，重復(fù)性較差，需要多次分析才能獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果。

為了進(jìn)一步研究流式細(xì)胞儀法是否能替代血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行細(xì)胞存活率計(jì)算，對兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀法與血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算的細(xì)胞存活率相關(guān)性分析

由圖5可以看出，兩種方法的相關(guān)系數(shù)R2=0.971，表明相關(guān)性很好。

3 結(jié)論

(1)應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率計(jì)算的關(guān)鍵為SS值限制、EV值限制、FL3范圍劃定3個步驟。通過SS值限制和EV值限制計(jì)算細(xì)胞濃度，通過FL3范圍劃定計(jì)算細(xì)胞存活率。

(2)應(yīng)用流式細(xì)胞儀計(jì)算的細(xì)胞濃度及細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，具有快速穩(wěn)定的特點(diǎn)。因此，在大規(guī)模的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，可以用流式細(xì)胞儀法替代血球計(jì)數(shù)板法對細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] Johnson M D，Schilz J，Djordjevic M V，et al.Evaluation ofinvitroassays for assessing the toxicity of cigarette smoke and smokeless tobacco[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(12):3263-3304.

[2] Jayapal K P，Wlaschin K F，Hu W S，et al.Recombinant protein therapeutics from CHO cells——20 years and counting[J].Chemical Engineering Progress，2007，103(10):40-47.

[3] 夭建華,陳輝敏,方力,等.國內(nèi)外卷煙危害性評價方法現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J].煙草科技,2007,(1):50-53.

[4] Wei Y Y，Naderi S，Meshram M，et al.Proteomics analysis of Chinese hamster ovary cells undergoing apoptosis during prolonged cultivation[J].Cytotechnology，2011，63(6):663-677.

[5] 高茜,管瑩,曾婉俐,等.體外連續(xù)傳代培養(yǎng)對生物工程細(xì)胞CHO凋亡的影響[J].化學(xué)與生物工程,2012，29(5):26-30.

[6] 管瑩,夭建華,高茜,等.CHO細(xì)胞初始接種密度對細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響[J].化學(xué)與生物工程,2012，29(9)：39-42.

[7] 萬歲桂,趙弘,徐娟,等.校正后的流式細(xì)胞術(shù)原始細(xì)胞計(jì)數(shù)在骨髓增生異常綜合征分型診斷中的應(yīng)用[J].內(nèi)科急危重癥雜志,2011,17(4):213-215.

[8] 萬歲桂,趙弘,徐娟,等.流式細(xì)胞術(shù)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)在骨髓增生異常綜合癥分型診斷中的作用[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2011,18(5):308-311.

[9] 陳必成,夏鵬,楊麗紅,等.兩種熒光染料——CFSE與碘化丙啶染色方法檢測細(xì)胞殺傷能力[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26(2):192.