聶紀芹 汪龔澤 劉朝奇 (三峽大學分子生物學研究所，宜昌443002)

膜聯(lián)蛋白A2(annexinA2)是廣泛表達在多細胞生物體內(nèi)的膜聯(lián)蛋白多基因家族的成員之一，廣泛存在于多種類型細胞中，包括骨髓細胞、神經(jīng)細胞、白細胞、單核細胞-巨噬細胞和內(nèi)皮細胞等［1］。它具有多種生理功能，如在生物膜結(jié)構(gòu)域的建立或穩(wěn)定、細胞增殖與分化、細胞膜骨架聯(lián)結(jié)、胞膜物質(zhì)運輸、細胞間粘附、粘合素介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗炎及凝血等功能［2，3］。

實驗證明，annexinA2與人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)，尤其是其在心血管、腫瘤疾病及病毒感染中的作用機制的研究成為當前的研究熱點［4-8］。有研究顯示大多數(shù)腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌及惡性血液病中都觀察到annexinA2過表達現(xiàn)象［9，10］。annexinA2 在腫瘤血管生成和浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，具有促進惡性腫瘤細胞增殖的特性［11］。為了研究annexinA2的功能，本實驗利用基因工程方法表達并純化截短的annexinA2蛋白，制備其多克隆抗體，并初步鑒定其生物學活性，為進一步研究annexinA2蛋白的生物學活性提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株 E.coli DH5、E.coli BL21(DE3)、質(zhì)粒pET28a(+)以及宮頸癌CaSKi細胞株系由本研究所保存。限制性核酸內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶均為Fermentas公司產(chǎn)品;鼠源His單克隆抗體(mAb)、HRP標記的羊抗小鼠IgG、HRP標記的羊抗兔IgG、羅丹明標記的羊抗兔IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。FITC標記的羊抗兔IgG購自湖北金茂生物技術(shù)有限公司。RPMI1640、胎牛血清購于Invitrogen公司。TMB購自eBioscience公司。弗氏佐劑購于Sigma公司。其他化學試劑由Sigma等公司提供。日本大耳朵白兔(6月齡，體質(zhì)量2千克，雄性)購于湖北省實驗動物中心(普通級，質(zhì)量合格證號00002964)。流式細胞儀由Beck-man Coulter公司提供。

1.2 方法

1.2.1 pET28a(+)-annexinA2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以人宮頸癌CaSki細胞系的cDNA為模板，擴增 annexinA2基因。上游引物:5'-GTGACCGACGAGGACTCTCTC-3'(劃線處為限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ酶切位點);下游引物:5'-GTGAGTCATCTCCACCACACAGGTA-3'(劃線處為限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ酶切位點)。擴增條件為:94℃ 3分鐘;94℃ 30秒;55℃ 30秒;72℃ 45秒;30個循環(huán);72℃ 5分鐘。用XhoⅠ和NcoⅠ分別雙酶切annexinA2 PCR產(chǎn)物和pET28a(+)原核表達載體。T4連接酶連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5a中培養(yǎng)，挑取單克隆進行酶切及測序鑒定。

1.2.2 annexinA2蛋白的原核表達 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a(+)-annexinA2轉(zhuǎn)化至宿主 BL21(DE3)中，30℃經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達過夜，收集細菌進行SDS-PAGE電泳，采用考馬斯亮藍R-250染色初步檢測目的蛋白表達。同時，收集細菌進行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2小時，以抗His-Tag鼠源單克隆抗(1∶5 000)為一抗，室溫孵育2小時，TBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫反應(yīng)50分鐘，ECL顯影。

1.2.3 annexinA2蛋白的純化 重組質(zhì)粒 pET28a(+)-annexinA2的陽性菌落經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達，離心收集菌體，重懸于PBS中(NaCl 137 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L)，4℃超聲波破碎，離心得到包涵體。上樣緩沖液溶解包涵體后，沸水煮5分鐘，SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE膠用冰冷的0.25 mol/L KCl染色5～10分鐘，切下目的蛋白碾碎，加等體積的PBS，4℃放置過夜，低溫離心取上清，上清即為回收純化的目的蛋白。將蛋白用含5%的甘油的PBS透析48小時，中間換液4～6次，即得到純化的目的蛋白。純化蛋白的抗原性分析:以His單抗(1∶5 000稀釋)為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋)為二抗，對純化產(chǎn)物進行Western blot鑒定。

1.2.4 annexinA2蛋白多克隆抗體的制備 將純化的annexinA2蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻并充分乳化后，于兔脊柱兩側(cè)多點皮內(nèi)注射，首次免疫劑量為500μg/只，首次免疫后2周，改為弗氏不完全佐劑混合，并進行第2次加強免疫，10天后第3次免疫，免疫劑量為100μg/只。第3次免疫1周后，頸動脈取血，分離兔血清，采用ELISA，流式和免疫熒光法測定抗體生物學活性。

1.2.5 抗體效價的測定 采用ELISA法，以純化的重組annexinA2蛋白(1μg/孔)作為包被抗原，一抗為兔抗血清(1∶10 000～1∶640 000)，二抗為HRP 標記的羊抗兔IgG，工作濃度為1∶3 000。TMB顯色，用全波長酶標儀在λ=450 nm處測定光密度(A450)值。

1.2.6 流式法測定annexinA2抗體特異性 CaSki細胞以2×108L-1濃度接種至細胞培養(yǎng)瓶，置37℃50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。2 mmol/L的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的CaSki細胞，制備活性高的細胞懸液。PBS洗1次，用PBS調(diào)整細胞密度為1×109L-1，每管100μl細胞懸液，平均分成多管，加入兔抗血清(1∶800)，以加入正常兔血清作為陰性對照，室溫作用30分鐘;PBS洗3次，加入FITC標記的羊抗兔IgG，室溫避光反應(yīng)30分鐘，PBS洗1次，加入0.5 ml PBS緩沖液重懸細胞，上機檢測，記錄、保存并軟件分析結(jié)果。

1.2.7 細胞免疫熒光法測定annexinA2抗體的特異性 CaSki細胞系用RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細胞以1×108L-1接種于細胞培養(yǎng)瓶，待細胞長滿后，將細胞傳入放有無菌玻片的24孔板中，培養(yǎng)48小時后取出細胞玻片;用冰冷的PBS洗3次，用10 g/L多聚甲醛4℃固定15～20分鐘;PBS洗3次，用150 ml/L的山羊血清室溫封閉1小時;PBS洗3次，滴加適當稀釋倍數(shù)的上述兔抗血清，37℃孵育1小時;PBS洗3次，用羅丹明標記的羊抗兔IgG 37℃孵育1小時;PBS洗3次，加入DAPI(5 g/L)室溫染核3～5分鐘，PBS洗3次后，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以人的宮頸癌CaSki細胞的cDNA為模板，設(shè)計引物，通過PCR的方法獲得截短annexinA2的基因片段，通過瓊脂糖凝膠電泳獲得預(yù)期約648 bp的片段(圖1A)，將獲得的陽性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后，得到預(yù)期大小的片段(圖1B)。陽性質(zhì)粒的測序結(jié)果與GenBank報告的基因序列完全相符，表明獲得了正確的annexinA2基因序列。

2.2 重組質(zhì)粒的表達、鑒定與純化 重組質(zhì)粒pET28a(+)-annexinA2轉(zhuǎn)化到蛋白表達菌 BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示重組質(zhì)?？稍?BL21中高表達，約28 kD處出現(xiàn)目的蛋白條帶(圖2A)。通過切膠回收的方法純化大量誘導(dǎo)表達的annexinA2蛋白，用His單抗作為抗體鑒定重組蛋白，結(jié)果顯示在約28 kD處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2B)。

2.3 兔血清多克隆抗體制備及檢測 將純化的等體積重組蛋白加入佐劑免疫日本大耳白兔后，獲得了annexinA2的兔抗血清，以正常兔血清作為陰性對照(100倍稀釋OD值為0.055)，通過 ELISA檢測，檢測結(jié)果顯示annexinA2抗體滴度可達105，并具有良好的量效關(guān)系(R2=0.942)，見圖3。

圖1 annexinA2基因片段的PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 annexinA2 PCR product and restriction fregment of recombine plasmid

2.4 FCM測定annexinA2抗體的結(jié)合活性 流式細胞術(shù)(FCM)檢測annexinA2抗體與人宮頸癌CaS-ki細胞內(nèi)源性annexinA2蛋白的結(jié)合活性，正常兔血清為陰性對照，得到的陽性細胞百分率為1.76%，加入兔抗血清的陽性細胞百分率為74.9%。由圖可見，annexinA2抗體可與CaSki細胞內(nèi)源性annexinA2蛋白結(jié)合(圖4)。

2.5 細胞免疫熒光法測定annexinA2抗體的結(jié)合活性 將培養(yǎng)的人的宮頸癌CaSki細胞表達內(nèi)源性annexinA2蛋白作為抗原，應(yīng)用細胞免疫熒光染色檢測annexinA2抗體的特異性。以正常兔血清為陰性對照，加入待測兔抗血清，用羅丹明標記的羊抗兔IgG為二抗進行染色，顯微鏡下觀察annexinA2抗體在CaSki細胞中的結(jié)合情況(圖5)。免疫熒光結(jié)果表明annexinA2抗體主要定位于細胞漿中，同型對照為陰性。

圖2 SDS-PAGE和Western blot分析原核表達及純化的annexinA2重組蛋白Fig.2 Analysis of expression and purification of annexinA2 recombinant protein by SDS-PAGE and Western blot

圖3 annexinA2兔抗血清的ELISA檢測Fig.3 annexinA2 polyclonal antibody detection by ELISA

圖4 FCM測定annexinA2抗體的結(jié)合活性Fig.4 annexinA2 polyclonal antibody detection by FCM

圖5 細胞免疫熒光法測定annexinA2抗體的特異性結(jié)合活性Fig.5 annexinA2 polyclonal antibody detection by CIF

3 討論

annexinA2最早在Rous肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的雞胚胎成纖維細胞中被發(fā)現(xiàn)。對其早期研究主要集中在參與炎癥機制的研究，如對蛋白激酶C和磷脂酶A2的抑制作用及參與細胞粘附、胞吐等。近年來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用［12］。實驗表明，annexinA2蛋白高表達與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。在許多人類腫瘤中都發(fā)現(xiàn)纖溶酶過表達，纖溶酶降解細胞外基質(zhì)的活性增高，有利于血管再生和細胞遷移，并且與annexinA2的表達量一致。在乳腺癌研究中，annexinA2在侵襲性乳腺癌的細胞株MDA-BM231中表達，而弱侵襲性細胞株MCF-7中不表達，而且annexinA2單抗可以阻斷纖溶蛋白酶依賴的腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移［13］。

本實驗克隆了人annexinA2的基因片段，構(gòu)建pET28a(+)-annexinA2的原核表達質(zhì)粒。該質(zhì)粒在BL21(DE3)細菌中可高效表達相對分子質(zhì)量約28 kD的重組蛋白。純化的目的蛋白免疫日本大耳白兔制備特異性多克隆抗體。經(jīng)ELISA、流式和免疫熒光法驗證抗體對細胞表達的抗原具有特異而高效的結(jié)合能力。該蛋白及抗體的成功制備，為進一步研究annexinA2的生物學活性及進一步尋找與annexinA2有關(guān)的腫瘤及病毒感染疾病的治療藥物提供了實驗基礎(chǔ)。

1 Claire Hastie，John R Masters，Stephen E Moss et al.Interferon reduces cell surface expression of Annexin 2 and suppresses the invasive capacity of prostate cancer cells［J］.Biological Chemistry，2008;283(18):1259-1265.

2 Ursula Rescher，Volker Gerke.Annexins-unique membrane binding proteins with diverse functions［J］.Cell Science，2004;117(13):2631-2639.

3 Luo W，Yan G，Li L et al.Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 mediates serine25 phosphorylation and nuclear entry of Annexin A2 via PI-PLC-PKCα/PKCβ pathway［J］.Mol Carcinog，2008;47(12):934-946.

4 Matthew J Hayes，Stephen E Moss.Annexins and Disease［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2004;322:1166-1170.

5 Shi Z X，Sun J F，Guo H C et al.Genomic expression profiling of peripheral blood leukocytes of pigs infected with highly virulent classic swine fever virus strain Shimen［J］.J Gen Virol，2009;90(7):1670-1680.

6 Jiang Y，Shi Z，Yan Y et al.Proteomic alteration of 592 PK-15 cells after infecton by classical swin fever virus［J］.JProteome Res，2008;7(12):5263-5269.

7 Shaw M L，Stone K L，Colangelo CM et al.Cellular proteins in influenza virus particles［J］.PLOSPathog，2008;4(6):e1000085.

8 Fanny L，Eri M，Guus F R et al.AnnexinⅡ inorporated into influenza virus particles supports virus replication by converting plasminogen into plasmin［J］.JVirol，2008;82(14):6820-6828.

9 趙 玲，崔全才.Annexin A2在腫瘤發(fā)生中的作用研究進展［J］.中華病理學雜志，2007;36(2):129-132.

10 蕭 笑，王 元，張思河.鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白AnnexinⅡ的研究進展［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2007;28(6):570-573.

11 Barwe SP，Anilkumar G，Moon S Y et al.Novel role for Na，K-ATPase in phosphatidylinositol 3-kinase signaling and suppression of cell motility［J］.Mol Biol Cell，2005;16(3):1082-1094.

12 趙麗萍，陸曉媛.Annexin A2、Bcl-2在宮頸癌中的表達及意義［J］.徐州醫(yī)學院學報，2010;30(8):507-510.

13 Sharma M，Ownbey R T，Sharma M C.Breast cancer cell surface annexinⅡinduces cell migration and neoangiogenesis via tPA dependent plasmin generation［J］.Exp Mol Pathol，2010;88(2):278-286.