史建峰 胡雪蓮 劉光偉 趙 勇

(中國科學(xué)院動(dòng)物研究所生物膜與膜生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室移植生物學(xué)研究組，北京100101)

1 Wip1基因和蛋白結(jié)構(gòu)

Wip1(Wild type p53-induced phosphatase 1)是于1997年由Fiscella等在尋找γ射線照射下p53基因的靶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，為一種依賴于p53高表達(dá)的原癌基因。Wip1屬于絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，主要定位于胞核內(nèi)，由PPM1D(Protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta)基因編碼。PPM1D位于人染色體17q23/q24區(qū)域，在小鼠中位于11號染色體與p53基因鄰近，共有6個(gè)編碼區(qū)。小鼠與人PPM1D基因有83%的同源性。人Wip1有605個(gè)氨基酸，分子量61 kD，小鼠Wip1包括598個(gè)氨基酸，分子量為66 kD。人Wip1序列可分為兩個(gè)主要區(qū)域，N端第1～375位氨基酸為高度保守的磷酸酶區(qū)，第376～605位氨基酸為低保守?zé)o催化區(qū)，第65～368位氨基酸與PP2C蛋白酶家族有高度同源性，其中N端有3個(gè)區(qū)域完全相同，第100～108位氨基酸是PP2C蛋白酶家族的標(biāo)簽，且Wip1激活依賴于二價(jià)陽離子和對岡田酸的不敏感，使之區(qū)別于PP1(Protein phosphatase type 1)、PP2A(Protein phosphatase type 2A)和PP2B(Protein phosphatase type 2B)家族磷酸蛋白酶，因此將Wip1歸屬于PP2C(Protein phosphatase type 2C)蛋 白酶 家族［1，2］。PPM1D 的mRNA在成年鼠和胚胎鼠的各種器官中均有表達(dá)，在雄鼠睪丸中表達(dá)水平最高［3］。

2 Wip1與DNA修復(fù)和腫瘤發(fā)生

對Wip1的研究主要集中于其對DNA修復(fù)及腫瘤發(fā)生的調(diào)控。2000年，小鼠PPM1D基因被克隆并測序，證實(shí)其在p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮極其重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用。它使p53蛋白去磷酸化而失活，導(dǎo)致其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路中斷，從而實(shí)現(xiàn)其抗凋亡功能［2］。Wip1對p53的調(diào)控作用具有多樣性而且參與許多重要生命活動(dòng)調(diào)節(jié)。外界環(huán)境壓力(如離子輻射、紫外光、化學(xué)試劑等)引起DNA損傷，機(jī)體存在一套精密的調(diào)節(jié)機(jī)制使DNA自我修復(fù)或者促進(jìn)病變細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明，Wip1蛋白可以對機(jī)體的DNA損傷修復(fù)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，Wip1蛋白表達(dá)依賴于p53蛋白［1，4］。Wip1可以通過負(fù)調(diào)控 p38、p53、ATM(Ataxia-telangiectasia mutated)、Chk1/Chk2等激酶來影響真核細(xì)胞DNA損傷修復(fù)功能:p38基因是第一個(gè)被確定的PPM1D靶基因，在紫外線或γ射線照射下，p38蛋白Thr180和Tyr182位點(diǎn)迅速發(fā)生磷酸化，p38蛋白激活后進(jìn)一步磷酸化其下游 p53 蛋白 Ser15、Ser33、Ser46和 Ser392位點(diǎn)，從而激活p53蛋白導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡［5，6］。而Wip1是p38-MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)/p53途徑中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，Wip1蛋白既可以通過去磷酸化p38蛋白(Thr180)蛋白激酶抑制p38通路下游分子p53蛋白的活性，也可以通過直接使p53蛋白(Ser15)去磷酸化而抑制其活性并終止其信號通路(圖 1)［4］。

ATM具有調(diào)控DNA修復(fù)和細(xì)胞周期關(guān)卡、維持染色體穩(wěn)定等生物功能。DNA損傷導(dǎo)致PIKK(Phosphatidylinositol 3-kinase-like protein kinases)激酶誘導(dǎo)ATM/ATR(Ataxia-telangiectasia and Rad3-related)等活化，ATR激酶使Chk1蛋白Ser317和Ser345位點(diǎn)發(fā)生磷酸化而被激活。ATM磷酸化引起Chk2的Ser516和Thr387發(fā)生自身磷酸化，使Chk2獲得激酶活性。Chk1和Chk2使下游p53蛋白和Cdc25(Cell division cyclin 25)家族成員和其他底物發(fā)生磷酸化，將損傷信號傳遞至下游，引發(fā)細(xì)胞周期阻滯及DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)效應(yīng)［7-10］，ATM還可以磷酸化MDM2(Murine double minute-2)Ser395位點(diǎn)，MDM2 是E3泛素連接酶，作為p53蛋白的抑制子MDM2與p53蛋白結(jié)合，促進(jìn)p53蛋白泛素化修飾和降解及其出核移位過程，從而抑制p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)p53蛋白也控制MDM2蛋白表達(dá)水平以保證細(xì)胞正常生命周期［11］。DNA損傷因素誘導(dǎo)p53蛋白/MDM2磷酸化修飾，ATM磷酸化MDM2的Ser395位點(diǎn)，其酸性保守區(qū)域Ⅱ(氨基酸237～260)高度磷酸化，從而抑制p53/MDM2復(fù)合體的形成，減弱MDM2對p53的降解作用［12，13］。Wip1 可以負(fù)調(diào)節(jié) ATM(Ser1981)、MDM2(Ser395)、Chk2(Thr68)的磷酸化從而抑制ATM和p53功能(圖1)。研究表明Wip1缺失導(dǎo)致ATM激酶的激活，過表達(dá)則明顯減少ATM的激活［14］。

Wip1負(fù)調(diào)控DNA損傷修復(fù)從而抑制細(xì)胞凋亡，使機(jī)體易于發(fā)生腫瘤，因此，Wip1表現(xiàn)出原癌基因特性。但是Wip1的致癌機(jī)制目前還未完全闡述清楚。Wip1在人乳腺癌、惡性腦瘤、卵巢癌中高表達(dá)［1，6，15-18］。研究表明，腫瘤發(fā)生時(shí)常會(huì)伴隨 p53 蛋白編碼基因TP53的突變，而Wip1過表達(dá)的乳腺癌病例中卻很少發(fā)現(xiàn) TP53 基因發(fā)生突變［6，19，20］，有人推測Wip1并不是誘發(fā)TP53基因突變引起腫瘤，而是通過抑制p53蛋白的功能促進(jìn)腫瘤發(fā)生。Wip1不僅可以通過調(diào)節(jié)ATM、MDM2、Chk1、Chk2和 p38MAPK間接負(fù)調(diào)控p53蛋白，還可以直接作用于p53使其N端(Ser15)去磷酸化導(dǎo)致失活［5］。但是，這些通路在腫瘤發(fā)生中的作用需要更多的癌癥模型佐證。

3 Wip1對免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用

圖1 Wip1調(diào)控p53的信號途徑簡圖Fig.1 The Wip1-p53 regulating pathway

Wip1基因的表達(dá)受一些非p53依賴的因子調(diào)控，如CREB(cAMP-response element binding protein)和 NF-κB［21-23］。NF-κB 在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它可以激活WIP1基因的表達(dá)。Wip1基因有一段保守的κB結(jié)合位點(diǎn)，并且上調(diào)和抑制NF-κB的功能分別導(dǎo)致Wip1表達(dá)升高和降低。研究證實(shí)，NF-κB的p65亞基可以直接結(jié)合到Wip1基因上游啟動(dòng)子從而調(diào)控其生物學(xué)活性［22］;反之 Wip1對NF-κB具有負(fù)調(diào)控作用，通過基因組水平的siRNA篩選發(fā)現(xiàn)抑制Wip1可以使NF-κB的活化能力增強(qiáng)。Wip1-/-小鼠 Hela細(xì)胞中 NF-κB目標(biāo)基因如TNF-α的mRNA表達(dá)升高，Wip1-/-小鼠脾細(xì)胞分泌NF-κB 依賴的炎癥因子上調(diào)，CD80+、MHCⅡ+和CD40+脾細(xì)胞比率也有相應(yīng)的升高，而Wip1過表達(dá)的小鼠Hela細(xì)胞中TNF-α等NF-κB依賴的細(xì)胞因子分泌量明顯降低［3］。研究表明，Wip1對NF-κB的調(diào)控發(fā)生在其與DNA結(jié)合的上游。Wip1通過使NF-κB的P65(Ser536)去磷酸化使 NF-κB不能招募共轉(zhuǎn)錄因子p300，導(dǎo)致其不能有效激活下游通路。Wip1也可以通過負(fù)調(diào)節(jié)p38來抑制NF-κB功能，使NF-κB 依賴的炎癥因子如 IL-1、6、8 表達(dá)量降低［24］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，Wip1-/-小鼠脾臟、淋巴結(jié)和骨髓都會(huì)發(fā)生不同程度的腫大并伴隨巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞增多，5%Wip1-/-小鼠發(fā)生皮膚潰瘍，Wip1-/-的小鼠在外界抗原刺激表現(xiàn)出免疫缺陷更容易受到感染。以上結(jié)果提示，Wip1具有抑制炎癥反應(yīng)的作用［3，24］。Wip1對NF-κB具有負(fù)調(diào)作用，腫瘤發(fā)生會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，NF-κB作為一個(gè)炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控腫瘤發(fā)生中也發(fā)揮了作用，但目前NF-κB對腫瘤發(fā)生的正負(fù)調(diào)控還存在爭議，所以Wip1是否可以通過調(diào)節(jié)NF-κB的功能間接調(diào)控腫瘤發(fā)生還有待更深層的研究。

Wip1對淋巴免疫細(xì)胞發(fā)育和功能具有調(diào)節(jié)功能，Wip1-/-幼年小鼠胸腺變小，胸腺髓質(zhì)區(qū)相對于正常小鼠顯著變小，TCR-β+的胸腺細(xì)胞數(shù)量顯著降低，TCR-γδ+細(xì)胞數(shù)卻不受影響。Wip1-/-小鼠SP期(CD4+或CD8+)和DP期(CD4+CD8+)細(xì)胞比率正常，但是細(xì)胞數(shù)目下降。DN期(CD4-CD8-)細(xì)胞數(shù)目正常，但是細(xì)胞比率增加。說明Wip1-/-小鼠胸腺細(xì)胞從DN期到SP期發(fā)育過程中存在缺陷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Wip1-/-小鼠DN3(CD44-CD25+)期細(xì)胞比率升高而DN4(CD44-CD25-)期比率和數(shù)量都發(fā)生下降，這是因?yàn)閃ip1 mRNA在DN3期向DN4期發(fā)育過程中表達(dá)升高，Wip1-/-小鼠胸腺細(xì)胞失去對p53蛋白活性負(fù)調(diào)功能，導(dǎo)致胸腺細(xì)胞由DN3期向DN4期發(fā)育時(shí)p53蛋白表達(dá)上調(diào)至使細(xì)胞周期阻滯，使更多的細(xì)胞處于S/G2/M期，從而引起Wip1-/-小鼠DN4期、DP期和SP期細(xì)胞數(shù)目減少［25］。

Wip1-/-小鼠外周免疫器官也有組織病理學(xué)表征，如脾臟白髓縮小、白髓與紅髓界限不清，并伴隨其他細(xì)胞浸潤。Wip1-/-小鼠脾臟T、B細(xì)胞數(shù)目相對于正常鼠沒有改變，但是CD4+細(xì)胞數(shù)增加，CD8+細(xì)胞數(shù)減少。T細(xì)胞和B細(xì)胞在外界抗原和絲裂原刺激后，表現(xiàn)出的增殖能力相比正常小鼠顯著下降［26］。Wip1可以影響淋巴細(xì)胞的發(fā)育分化及其功能，Wip1在免疫監(jiān)視和機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)解中可能發(fā)揮功能，對免疫細(xì)胞殺傷癌變細(xì)胞保持機(jī)體穩(wěn)態(tài)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)束語

雖然Wip1早在1997年就已發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤發(fā)生、免疫系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。但目前我們對Wip1的研究仍不夠全面。在腫瘤和免疫疾病模型中Wip1調(diào)控分子機(jī)制有待探究。Wip1對免疫器官的發(fā)育及免疫細(xì)胞各亞群的增殖、分化和細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要深入研究。

1 Fiscella M，Zhang H，F(xiàn)an S et al.Wip1，a novel human protein phosphatase that is induced in response to ionizing radiation in a p53-dependent manner［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94(12):6048-6053.

2 Choi J，Appella E，Donehower L A.The structure and expression of the murine wildtype p53-induced phosphatase 1(Wip1)gene［J］.Genomics，2000;64(3):298-306.

3 Choi J，Nannenga B，Demidov O N et al.Mice deficient for the wildtype p53-induced phosphatase gene(Wip1)exhibit defects in reproductive organs，immune function，and cell cycle control［J］.Mol Cell Biol，2002;22(4):1094-1105.

4 Lu X，Nannenga B，Donehower L A.PPM1D dephosphorylates Chk1 and p53 and abrogates cell cycle checkpoints［J］.Mol Cell，2005;19(10):1162-1174.

5 Takekawa M，Adachi M，Nakahata A et al.p53-inducible wip1 phosphatase mediates a negative feedback regulation of p38 MAPK-p53 signaling in response to UV radiation［J］.EMBO J，2000;19(23):6517-6526.

6 Bulavin D V，Demidov O N，Saito S et al.Amplification of PPM1D in human tumors abrogates p53 tumor-suppressor activity［J］.Nat Genet，2002;31(2):210-215.

7 Lu X，Nguyen TA，Donehower L A.Reversal of the ATM/ATR-mediated DNA damage response by the oncogenic phosphatase PPM1D［J］.Cell Cycle，2005;4(8):1060-1064.

8 Abraham R T.Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases［J］.Gene Dev，2001;15(17):2177-2196.

9 Shiloh Y.ATM and related protein kinases:safeguarding genome integrity［J］.Nat Rev Cancer，2003;3(3):155-168.

10 Kastan M B，Lim D S.The many substrates and functions of ATM［J］.Nat Rev Mol Cell Bio，2000;1(3):179-186.

11 Lu X，Ma O，Nguyen TA et al.The Wip1 Phosphatase acts as a gatekeeper in the p53-Mdm2 autoregulatory loop［J］.Cancer Cell，2007;12(4):342-354.

12 Batchelor E，Mock C S，Bhan I et al.Recurrent initiation:a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage［J］.Mol Cell，2008;30(3):277-289.

13 Batchelor E，Loewer A，Lahav G.The ups and downs of p53:understanding protein dynamics in single cells［J］.Nat Rev Cancer，2009;9(5):371-377.

14 Shreeram S，Demidov O N，Hee W K et al.Wip1 phosphatase modulates ATM-dependent signaling pathways［J］.Mol Cell，2006;23(5):757-764.

15 Harrison M，Li J，Degenhardt Y et al.Wip1-deficient mice are resistant to common cancer genes［J］.Trends Mol Med，2004;10(8):359-361.

16 Castellino R C，De Bortoli M，Lu X et al.Medulloblastomas overexpress the p53-inactivating oncogene WIP1/PPM1D［J］.J Neurooncol，2008;86(3):245-256.

17 Chaffin CL，Brogan R S，Stouffer R L et al.Dynamics of Myc/Max/Mad expression during luteinization of primate granulosa cells in vitro:association with periovulatory proliferation［J］.Endocrinology，2003;144(4):1249-1256.

18 Bang J，Yamaguchi H，Durell SR et al.A small molecular scaffold for selective inhibition of Wip1 phosphatase［J］.Chem Med Chem，2008;3(2):230-232.

19 Rauta J，Alarmo E L，Kauraniemi P et al.The serine-threonine protein phosphatase PPM1D is frequently activated through amplification in aggressive primary breast tumours［J］.Breast Cancer Res TR，2006;95(3):257-263.

20 Yu E，Ahn Y S，Jang SJ et al.Overexpression of the wip1 gene abrogates the p38 MAPK/p53/Wip1 pathway and silences p16 expression in human breast cancers［J］.Breast Cancer Res TR，2007;101(3):269-278.

21 Hershko T，Korotayev K，Polager S et al.E2F1 modulates p38 MAPK phosphorylation via transcriptional regulation of ASK1 and Wip1［J］.JBiol Chem，2006;281(42):31309-31316.

22 Lowe JM，Cha H，Yang Q et al.Nuclear factor-κB(NF-κB)is a novel positive transcriptional regulator of the oncogenic Wip1 phosphatase［J］.JBiol Chem，2009;285(8):5249-5257.

23 Rossi M，Demidov O N，Anderson C W et al.Induction of PPM1D following DNA-damaging treatments through a conserved p53 response element coincides with a shift in the use of transcription initiation sites［J］.Nucleic Acids Research，2008;36(22):7168-7180.

24 Chew J，Biswas S，Shreeram S et al.WIP1 phosphatase is a negative regulator of NF-kappaB signalling［J］.Nat Cell Biol，2009;11(5):659-666.

25 Schito M L，Demidov O N，Saito S et al.Wip1 phosphatase-deficient mice exhibit defective T cell maturation due to sustained p53 activation［J］.J Immunol，2006;176(8):4818-4825.

26 Choi J，Nannenga B，Demidov O D N et al.Mice deficient for the Wild-type p53-induced phosphatase gene(Wip1)exhibit defects in reproductive organs，immune function，and cell cycle control［J］.Mol Cell Biol，2002;22(4):1094-1105.