蓋曉東，歷 春，李 倩，劉艷波，薛昊罡

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是腫瘤化療失敗及腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因。迄今至少已發(fā)現(xiàn)13種與MDR相關(guān)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體，P－糖蛋白(p－glycoprotein，P－gp)是其中最重要的一員［1］。維拉帕米、環(huán)孢霉素等常見(jiàn)的耐藥逆轉(zhuǎn)劑，由于正常血藥濃度難以達(dá)到療效或存在明顯的不良反應(yīng)而在應(yīng)用上受到限制。目前國(guó)內(nèi)中藥廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，其中提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性是臨床使用中藥的一個(gè)重要目的。目前已發(fā)現(xiàn)多種中藥有著較好的逆轉(zhuǎn)MDR作用，其可能的機(jī)制與抑制MDR蛋白的活性、影響MDR基因的表達(dá)、促進(jìn)耐藥性腫瘤細(xì)胞的凋亡等有關(guān)［2－3］。柴胡為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有解表和里、疏肝解郁等功效，其粗提物具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR的作用［4］。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)從柴胡中提取出的多糖(Bupleurum chinese polysaccharides，BCPS)、皂苷(Saikoside，SS)等多種組分進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SS具有MDR逆轉(zhuǎn)作用，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)SS對(duì)K562/ADM細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用以及初步逆轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)行了研究，探索該藥在抗人白血病MDR方面的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1 材料

IMDM培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品。四甲基偶氮唑［3－(4，5－dimethylthiazol－2 －yl)－2，5－diphenyl－tetrazolium bromide，MTT］、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)為 Sigma產(chǎn)品。維拉帕米(verapamil，VER)為上海市禾豐制藥有限公司產(chǎn)品。鹽酸多柔比星(又稱阿霉素，adriamycin，ADM)為浙江省海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。超級(jí)新生牛血清為上海依科賽生物制品有限公司產(chǎn)品。Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為凱基公司產(chǎn)品。北柴胡(市售，經(jīng)鑒定為正品北柴胡)。K562細(xì)胞和 K562/ADM細(xì)胞由吉林大學(xué)再生研究所提供。酶標(biāo)儀(Tecan Genios)。流式細(xì)胞儀(Beckman)。

2 方法

2.1 柴胡皂苷提取 將柴胡在40～50℃的烘箱中烘7～8 h，充分干燥后，用植物粉碎機(jī)將其粉碎，取柴胡粉末100 g。加入70%乙醇500 mL，60℃下，回流提取2 h，抽濾，濾渣反復(fù)提取3次，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到浸膏，適量蒸餾水使其充分溶解后，加入水飽和正丁醇反復(fù)萃取3次。萃取液經(jīng)55℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除大部分溶劑后，于80℃烘箱中徹底烘干，磨碎后得到棕褐色柴胡總皂苷粉末2.8 g，收率為2.8%。

2.2 MTT法檢測(cè)SS的藥物毒性作用 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562和K562/ADM細(xì)胞(1×108/L)，接種在96孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的SS(1～100 mg/L)，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基不加藥物。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h，每孔加入15 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。2000 r/min離心5 min，傾去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩 10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定 A570值，每組各設(shè)3個(gè)平行孔。確定對(duì)K562/ADM細(xì)胞抑制率≤10%的藥物濃度為SS的非細(xì)胞毒性劑量。抑制率=1－(對(duì)照孔A值－實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%。

2.3 MTT法檢測(cè)SS對(duì)K562/ADM細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/ADM細(xì)胞(1×108/L)接種在96孔板內(nèi)，選用SS非細(xì)胞毒性劑量以下濃度1.25、2.5、5.0 mg/L和陽(yáng)性對(duì)照VER 5 mg/L分別與不同濃度ADM(0.05～100 mg/L)聯(lián)合作用于K562/ADM細(xì)胞。方法同2.2測(cè)定A570值，每組各設(shè)3個(gè)平行孔。計(jì)算各組的50%抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)，求出SS作用后的逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversal index，RI)，RI=耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)前的 IC50/耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)后的IC50。

計(jì)算2種藥物A、B相互作用系數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI)，CDI=AB/(A × B)，A 為 A 藥物單獨(dú)作用與對(duì)照組的比值，B為B藥物單獨(dú)作用與對(duì)照組的比值，AB為兩藥共同作用與對(duì)照組的比值。CDI＜1，兩藥具有協(xié)同作用;CDI＜0.07，兩藥物具有明顯的協(xié)同作用［5－6］。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM濃度 為了更有效檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM濃度，我們使用的ADM濃度為50 mg/L，是ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞的 IC50。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/ADM細(xì)胞(4×108/L)接種在6孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM 50 mg/L;(3)K562/ADM+ADM 50 mg/L+VER 5 mg/L;(4)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 5 mg/L;(5)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 2.5 mg/L;(6)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 1.25 mg/L。5%CO2、37℃培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，PBS洗2遍，依據(jù)ADM本身發(fā)熒光的特點(diǎn)，用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)575 nm)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 ADM對(duì)細(xì)胞凋亡影響具有時(shí)間和劑量依賴性，50 mg/L ADM作用24 h細(xì)胞碎片較多，因此選擇10 mg/L ADM。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 K562/ADM(4×108/L)接種6孔板中，每孔1 mL。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM(10mg/L)+SS(1.25、2.5 和5 mg/L);(3)K562/ADM+ADM(10 mg/L)+VER(5 mg/L)。5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞于EP管中，PBS洗1次，采用Annexin V和PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)575 nm)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/ADM細(xì)胞(4×108/L)接種6孔板中，每孔1 mL，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM(50 mg/L);(3)K562/ADM+ADM(50 mg/L)+VER(5 mg/L);(4)K562/ADM+ADM(50 mg/L)+SS(1.25、2.5 和 5 mg/L)。5%CO2、37℃培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，70%乙醇4℃過(guò)夜，PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)575 nm)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

結(jié) 果

1 SS對(duì)K562和K562/ADM細(xì)胞的毒性作用

SS(1～100 mg/L)6個(gè)濃度作用48 h后，隨著濃度的增加，K562和K562/ADM細(xì)胞的增殖抑制率也相應(yīng)增加，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖1。SS對(duì)K562/ADM細(xì)胞的非細(xì)胞毒性劑量為5.0 mg/L，抑制率＜10%。因此，選擇SS非細(xì)胞毒性劑量以下的濃度作為最佳藥物逆轉(zhuǎn)濃度。SS對(duì)K562和K562/ADM細(xì)胞的IC50值分別為9.25 mg/L和29.9 mg/L。

Figure 1.Inhibitory rates of the proliferation of K562 and K562/ADM cells after treated with SS.圖1 SS作用下K562和K562/ADM細(xì)胞的增殖抑制率

2 SS對(duì)K562/ADM細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用

SS的非細(xì)胞毒性劑量為5.0 mg/L，取1.25 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L與不同濃度的ADM(0.05～100 mg/L)聯(lián)合作用于K562/ADM細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)作用研究，測(cè)定IC50。從表1可以看出3個(gè)濃度的SS與不同濃度ADM的聯(lián)合作用均可使K562/ADM的IC50明顯下降，呈現(xiàn)劑量依賴性，與逆轉(zhuǎn)前IC50比較均有顯著差異(P＜0.01)。其中以5.0 mg/L SS逆轉(zhuǎn)效果最佳，逆轉(zhuǎn)指數(shù)達(dá)到21.5倍，而陽(yáng)性逆轉(zhuǎn)劑VER的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為13.5倍。

表1 SS與ADM聯(lián)合作用下K562/ADM細(xì)胞株耐藥性的逆轉(zhuǎn)指數(shù)Table 1.Reversal index(RI)of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

表1 SS與ADM聯(lián)合作用下K562/ADM細(xì)胞株耐藥性的逆轉(zhuǎn)指數(shù)Table 1.Reversal index(RI)of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

*P ＜0.05 vs ADM group.

ADM 0 49.53 ±3.10—13.5 ADM+SS 1.25 5.93 ±0.12* 8.42.5 4.98 ±0.13* 10.05.0 2.31 ±0.36* 21.5 ADM+VER 5.0 3.67 ±0.33*

3 SS與ADM的協(xié)同作用

經(jīng)計(jì)算，SS濃度為1.25、2.5和5.0 mg/L各組的CDI值分別為0.92、0.89和0.82，均 ＜1，表明 SS與ADM具有協(xié)同作用。

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，SS協(xié)同ADM作用后，腫瘤細(xì)胞除了增殖受到抑制外，也出現(xiàn)了大量凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿濃縮、體積縮小、核碎裂呈小塊，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The morphology of K562/ADM cells after treated with different concentrations of SS and ADM for 48 h.A:K562/ADM;B:SS 1.25 mg/L+ADM 5 mg/L;C:SS 2.5 mg/L+ADM 5 mg/L;D:SS 5 mg/L+ADM 5 mg/L.圖2 不同濃度的SS與ADM作用K562/ADM細(xì)胞48 h后的形態(tài)

4 SS作用下K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的變化

不同濃度非細(xì)胞毒性劑量SS聯(lián)合ADM分別作用于K562/ADM細(xì)胞4 h后，隨著SS濃度的增加K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度相應(yīng)增加，與ADM單獨(dú)作用的K562/ADM細(xì)胞比較差異顯著(P＜0.05)，陽(yáng)性對(duì)照VER也可明顯增加K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度(P＜0.05)。而不同濃度非細(xì)胞毒性劑量SS聯(lián)合ADM作用于K562細(xì)胞后，各組細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度與ADM單獨(dú)作用的K562細(xì)胞比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表2。提示SS可增加K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM的蓄積。

5 SS對(duì)K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響

在不同濃度的非細(xì)胞毒性劑量SS聯(lián)合ADM作用K562/ADM細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞凋亡率與單用ADM組相比均明顯增加(P＜0.05)，可見(jiàn)非細(xì)胞毒性劑量SS能夠增強(qiáng)ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，見(jiàn)圖3。

6 SS作用下細(xì)胞周期時(shí)相分布的變化

ADM單獨(dú)作用于K562/ADM細(xì)胞4 h后與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)。當(dāng)ADM分別與不同濃度的非細(xì)胞毒性劑量SS作用K562/ADM細(xì)胞4 h后，各組細(xì)胞與ADM單獨(dú)作用比較G0/G1期細(xì)胞均明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)，表明SS具有增加ADM作用于K562/ADM細(xì)胞的G0/G1期增殖阻滯作用，見(jiàn)表3。

表2 SS與ADM聯(lián)合作用下K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的變化Table 2.The changes of ADM level in K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

表2 SS與ADM聯(lián)合作用下K562/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的變化Table 2.The changes of ADM level in K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

*P ＜0.05 vs ADM group(K562/ADM).

Group K562/ADM K56256.20 ±3.89 ADM 22.80 ±2.39 50.70 ±2.67 ADM+SS 1.25 mg/L 31.90 ±2.04* 54.30 ±2.122.5 mg/L 35.20 ±1.98* 53.10 ±1.895.0 mg/L 38.50 ±2.56* 53.90 ±2.92 ADM+VER 46.70 ±2.24*

Figure 3.The apoptosis of K562/ADM after treated with SS and ADM.1:K562/ADM+ADM 10 mg/L;2:K562/ADM+ADM 10 mg/L+VER 5 mg/L;3:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 1.25 mg/L;4:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 2.5 mg/L;5:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 5 mg/L.*P ＜0.05 vs group 1.圖3 SS聯(lián)合ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響

表3 SS聯(lián)合ADM作用下K562/ADM細(xì)胞細(xì)胞周期變化Table 3.The changes of cell cycle of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(%..n=3)

表3 SS聯(lián)合ADM作用下K562/ADM細(xì)胞細(xì)胞周期變化Table 3.The changes of cell cycle of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(%..n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs ADM group.

Group G0/G1S Control 24.80 ±5.64 72.30 ±2.98 ADM 32.90 ±3.29* 61.50 ±3.65*ADM+SS 1.25 mg/L 41.50 ±3.94*# 52.10 ±4.77*#2.5 mg/L 49.60 ±4.67*# 46.60 ±3.95*#5.0 mg/L 55.70 ±5.28*# 34.20 ±5.74*#ADM+VER 49.60 ±4.76*# 42.30 ±4.21*#

討 論

白血病MDR是白血病化療的一大障礙，克服白血病MDR，提高抗癌藥物療效已經(jīng)成為白血病治療亟待解決的關(guān)鍵性課題。體外被證實(shí)具有逆轉(zhuǎn)耐藥活性的化合物或生物制劑有很多，如環(huán)胞霉素、異博定等，但因它們對(duì)心、腎的毒性，使其臨床應(yīng)用受到限制。研究白血病MDR，尋找有效低毒的逆轉(zhuǎn)劑，一直是人們感興趣的研究課題。

自從Tsuruo等［7］報(bào)道異搏定具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥以來(lái)，相繼發(fā)現(xiàn)了數(shù)種化療藥物逆轉(zhuǎn)劑，特別是鈣通道阻滯劑(calcium channel blocker，CCB)藥物逆轉(zhuǎn)效果最為可靠，但化學(xué)藥物因本身的毒副作用限制其臨床應(yīng)用。柴胡具有和解泄熱、疏肝解郁和抗腫瘤等作用，其粗提物具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用［4］。SS是從柴胡中提取的有效活性成分，毒性小，非毒劑量的SS 1.25、2.5和5 mg/L能夠增強(qiáng)K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，使其對(duì)ADM的IC50明顯下降，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為8.4倍、10.0倍和21.5倍，表明SS能部分逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞的耐藥性。細(xì)胞形態(tài)觀察也證實(shí)了非毒劑量的SS協(xié)同ADM作用后，腫瘤細(xì)胞除了增殖受到抑制外，也出現(xiàn)了大量的凋亡細(xì)胞。同時(shí)CDI值分別為0.92、0.89和0.82，均小于1。表明SS與ADM具有協(xié)同作用。

因ADM能自發(fā)熒光，細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ADM濃度呈正相關(guān)，即熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞內(nèi)ADM濃度［8］。本研究結(jié)果顯示:SS聯(lián)合ADM作用K562/ADM細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯提高，提示SS可以增加K562/ADM細(xì)胞中ADM的蓄積。MDR的形成機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，包括經(jīng)典耐藥標(biāo)志蛋白P－gp、細(xì)胞周期調(diào)控異常、凋亡基因表達(dá)失控及DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)等因素［9－10］。

研究表明，腫瘤細(xì)胞獲得MDR主要的機(jī)制之一就是通過(guò)逃逸凋亡或拮抗凋亡而獲得的。因此，誘導(dǎo)MDR腫瘤細(xì)胞凋亡，可為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)［11－13］。我們的研究也證實(shí)了 SS可以使 ADM 作用下的K562/ADM細(xì)胞凋亡率明顯增加，從而提高K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SS處理后G0/G1期細(xì)胞明顯增加，G2/M期的分裂受到了抑制。G1期為細(xì)胞分化期，也是藥物作用的敏感期，提示SS逆轉(zhuǎn)作用可能是通過(guò)將K562/ADM細(xì)胞阻滯在G0/G1期而發(fā)揮作用。

綜上所述，SS對(duì)K562/ADM細(xì)胞具有一定的增殖抑制和逆轉(zhuǎn)作用，其逆轉(zhuǎn)作用可能是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)化療藥物的蓄積，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和將 K562/ADM細(xì)胞阻滯在G0/G1期從而抑制其增殖，其它相關(guān)逆轉(zhuǎn)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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