來麗娜， 宋曉亮， 任澤恩， 楊柳絮， 王黎敏， 鄭王巧， 郭春花， 張曉一

(長治醫(yī)學(xué)院1藥理教研室，3 肝病研究所，4 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，2 長治市第二人民醫(yī)院，山西 長治046000)

肝纖維化是所有慢性肝病共有的病理特征，是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，在此過程中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。目前臨床仍沒有療效好、不良反應(yīng)少的抗肝纖維化藥物。我國中藥資源豐富，從天然藥物中發(fā)掘抗肝纖維化藥物具有廣闊的前景。青蒿琥酯(artesunate，Art)是青蒿素水溶性衍生物，前期實(shí)驗(yàn)表明Art 對四氯化碳(carbon tetrachloride，CCL4)導(dǎo)致的大鼠肝纖維化模型和牛血清白蛋白導(dǎo)致的大鼠肝纖維化模型有防治作用［1－2］，且體外可抑制HSC－T6 細(xì)胞的增殖，阻止其從G0/G1期進(jìn)入S期［3］。本實(shí)驗(yàn)用血小板源性生長因子BB(platelet－derived growth factor BB，PDGF－BB)刺激HSC－T6細(xì)胞，觀察不同濃度的Art 對HSCs 增殖信號分子的影響，進(jìn)一步探討Art 抗肝纖維化作用的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 試劑 Art(原料藥，廣西桂林制藥二廠);RNAiso Plus 抽提試劑(TaKaRa)，DL2000 DNA marker(TaKaRa)，RNA PCR Kit(AMV)3.0(TaKaRa)，Western blotting 細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，大鼠Ⅰ型膠原ELISA 試劑盒(上海時代科技發(fā)展有限公司)，Western Blue? anti－mouse IgG(Promega)，小鼠來源甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)Ⅰ抗(碧云天生物技術(shù)研究所)，小鼠來源cyclin D1 Ⅰ抗(Santa Cruz)。磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal－regulated kinase，p－ERK)單克隆抗體和ERK 特異性阻斷劑PD98059 均購自Promega。PDGF－BB(PeproTech)，EMSA/Gel－Shift 試劑盒和EMSA 用AP－1 探針購自碧云天生物技術(shù)研究所;核蛋白提取試劑盒購自Active Motif，［γ－32P］ATP 購自北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司，PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 儀器 CL31R 低溫超速離心機(jī)(Thermo)，核酸蛋白分析儀(Bio－Rad)，S1000PCR 擴(kuò)增儀(Bio－Rad)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha Innotech)，MK3 酶標(biāo)儀(Thermo);IX70 倒置顯微鏡(奧林巴斯)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(NuAire)，SW－CJ－ZFD 超凈工作臺(中國安泰公司)。

2 方法

2.1 HSC－T6 細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HSC－T6細(xì)胞株由長治醫(yī)學(xué)院肝病研究所趙中夫教授惠贈，用DMEM 常規(guī)培養(yǎng)。將指數(shù)生長期的細(xì)胞按1 ×109/L 密度接種。待細(xì)胞鋪滿約70%時，換無血清的DMEM 培養(yǎng)6 h，而后分為6 組:對照組;PDGF－BB 組(終濃度60 μg/L);PDGF－BB +Art 組(用60 μg/L PDGF－BB 預(yù)處理30 min 后再加入6.25 mg/L、25 mg/L 和50 mg/L Art)，PDGF－BB +PD98059組(用60 μg/L PDGF－BB 預(yù)處理30 min 后再加入終濃度為100 μmol/L PD98059)，藥物作用24 h。

2.2 ELISA 法測定HSCs 培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原的含量 采用雙抗夾心ELIS(A)法，分組同上。按說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，收集上清液測定Ⅰ型膠原的吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Ⅰ型膠原的含量。

2.3 RT－PCR 測定ERK1/2 和cyclin D1 mRNA 的表達(dá) RNAiso Plus 提取HSCs 總RNA，核酸蛋白分析儀測定其含量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以總RNA 1 μg 為模板，用oligo (dT)引物反轉(zhuǎn)錄RNA 為cDNA，然后加入待測定指標(biāo)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。ERK1/2(451 bp)上游引物5'－GCT GAC CCT GAG CAC GAC CA－3'，下游引物5'－CTG GTT CAT CTG TCG GAT CA－3';cyclin D1 (449 bp)上游引物5'－TGT TCG TGG CCT CTA AGA TG－3'，下游引物5'－ACT CCA GAA GGG CTT CAA TC－3';β－actin (300 bp)上游引物5'－AGC TGA GAG GGA AAT CGT GCG－3'，下游引物5'－GTG CCA CCA GAC AGC ACT GTG－3'。PCR反應(yīng)條件:ERK1/2(94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán))，cyclin D1(94 ℃30 s，55 ℃30 s，72℃1 min，30 個循環(huán))，內(nèi)參照β－actin(94 ℃45 s，60℃45 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán))。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)照相及測定條帶的灰度值，目的條帶與同一樣品的β－actin條帶的灰度值的比值代表mRNA 的表達(dá)水平。

2.4 Western blotting 檢測細(xì)胞內(nèi)p－ERK 和cyclin D1 蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞加入裂解液勻漿，低溫離心，蛋白定量。取總蛋白50 μg，經(jīng)10 %聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后分別加入Ⅰ抗(1∶500)，4 ℃過夜，次日洗膜后再與堿性磷酸酶偶聯(lián)的Ⅱ抗雜交(1∶2 000)，Western Blue? Substrate 顯色。以目的條帶與同一樣品的內(nèi)參照GAPDH 條帶的灰度值的比值代表蛋白的表達(dá)量。

2.5 EMSA 法檢測AP－1 與DNA 結(jié)合的活性

(1)細(xì)胞核蛋白提取按試劑盒說明書操作。(2)AP－l 寡核苷酸探針的標(biāo)記:AP－l 的2 段序列為5'－CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA－3' 和3'－GCG AAC TAC TGA GTC GGC CTT－5'。待標(biāo)記AP－1 寡核苷酸探針(1.75 μmol/L)2 μL，10 ×T4 kanase buffer 1 μL，nuclease－free water 5 μL，［γ－32P］ATP(3.7 ×1014Bq/L)1 μL，T4 polynucleotide kinase 1 μL，總體積10 μL，設(shè)立陰性對照(反應(yīng)體系中未加細(xì)胞核提取物)，冷探針競爭反應(yīng)組(在反應(yīng)體系中加入未標(biāo)記AP－l 雙鏈探針)，37 ℃反應(yīng)10 min。(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影:用考馬斯亮藍(lán)G250 試劑盒測定蛋白濃度，取5 μg 核蛋白，按EMSA kit 說明書進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，室溫下孵育20 min。采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，60 V 電泳1 h。將凝膠置濾紙上，壓片，－70 ℃冰箱中放射自顯影24 h，沖洗膠片。將顯影結(jié)果掃描入計算機(jī)內(nèi)，以積分灰度值表示AP－l 與DNA 的結(jié)合活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠HSC－T6 細(xì)胞I 型膠原的表達(dá)情況

與對照組比較，PDGF－BB 組Ⅰ型膠原表達(dá)量明顯升高(P ＜0.01)。PDGF－BB +Art 各劑量組Ⅰ型膠原表達(dá)量均小于PDGF－BB 組(P ＜0.05，P ＜0.01)，經(jīng)PD98059 預(yù)處理阻斷ERK1/2 通路后，PDGF－BB 的促HSCs I 型膠原表達(dá)的作用也受到抑制，與PDGF－BB 組比較差異顯著(P ＜0.05)，見表1。

表1 各組HSC－T6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液Ⅰ型膠原濃度的變化Table 1. Changes of collagen Type Ⅰconcentration in cell culture supernatants of HSC－T6 cells in different groups(μg/L. ±s.n=9)

表1 各組HSC－T6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液Ⅰ型膠原濃度的變化Table 1. Changes of collagen Type Ⅰconcentration in cell culture supernatants of HSC－T6 cells in different groups(μg/L. ±s.n=9)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.

Group Dose Collagen type ⅠControl 90.7±10.1 PDGF－BB 60 μg/L 148.8±12.5△△PDGF－BB +Art 6.25 mg/L 122.6±12.1△＊25 mg/L 119.5±14.6△＊50 mg/L 94.1±12.4＊＊PDGF－BB +PD98059 100 μmol/L 115.2±13. 8△＊

2 ERK1/2 和cyclinD1 mRNA 在各組HSC－T6細(xì)胞中的表達(dá)

RT－PCR 結(jié)果顯示:PDGF－BB 可誘導(dǎo)HSC－T6 細(xì)胞內(nèi)ERK1/2 mRNA 的表達(dá)增多，但與對照組比較無顯著差異(P ＞0.05)，PDGF－BB + Art(50 mg/L)組，HSCs 細(xì)胞內(nèi)ERK1/2 mRNA 的表達(dá)量明顯低于PDGF－BB 組(P ＜0.05)，而PDGF－BB +Art(25 mg/L、6.25 mg/L)組與對照組比較無顯著差異(P ＞0.05)，PDGF－BB + PD98059 組ERK1/2mRNA 的表達(dá)明顯受到抑制(P ＜0.01);隨著Art劑量增加對cyclin D1 mRNA 表達(dá)量的抑制作用逐漸增強(qiáng)，PDGF－BB + Art(25 mg/L、50 mg/L)組與PDGF－BB 組比較有顯著差異(P ＜0.05)，PDGF－BB+PD98059 組cyclinD1 mRNA 的表達(dá)量與PDGF－BB 組比較也明顯下降(P ＜0.05)，見圖1。

3 p－ERK1/2 蛋白和cyclin D1 蛋白在各組HSC－T6 細(xì)胞中的表達(dá)

Western blotting 結(jié)果顯 示:PDGF－BB 可使HSCs 內(nèi)p－ERK1/2 蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P ＜0.01);加入不同劑量Art 后，HSCs 內(nèi)p－ERK1/2 的表達(dá)量下降，隨著Art 劑量增加抑制作用越明顯;PDGF－BB + PD98058 組HSC－T6 細(xì) 胞 內(nèi)p－ERK1/2 的表達(dá)最低，cyclin D1 蛋白表達(dá)趨勢與p－ERK1/2 蛋白相似，見圖2。

4 實(shí)驗(yàn)各組AP－1 活化的情況

抽提細(xì)胞核提取物進(jìn)行EMSA 測定AP－1 活性，檢測到了AP－1 和DNA 形成的復(fù)合體陽性信號，Art 干預(yù)HSC－T6 細(xì)胞后，AP－1 和DNA 形成的復(fù)合體陽性信號逐漸減小，且隨Art 濃度的增大，檢測到的信號越小，PDGF－BB + PD98059 組信號更弱，與PDGF－BB 組比較差異顯著(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 1. The expression of ERK1/2 and cyclin D1 mRNA in HSC－T6 cells in different groups. A:RT－PCR pictures of ERK1/2 mRNA and cyclin D1 mRNA expression;B:quantitative analysis of the ratios of ERK1/2 and cyclin D1 to β－actin. M:DNA marker;Lane 1:control group;Lane 2:PDGF－BB group;Lane 3:PDGF－BB+Art(6.25 mg/L)treated group;Lane 4:PDGF－BB + Art(25 mg/L)treated group;Lane 5:PDGF－BB + Art(50 mg/L)treated group;Lane 6:PDGF－BB+PD98059(100 μmol/L)treated group. ±s.n=6. △P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.圖1 實(shí)驗(yàn)各組HSC－T6 細(xì)胞ERK1/2 mRNA and cyclinD1 mRNA 的表達(dá)

Figure 2. The protein expression of p－ERK1/2 and cyclin D1 in HSC－T6 cells in different groups. A:Western blotting picture of p－ERK1/2 and cyclin D1 protein expression.Lane 1:control group;Lane 2:PDGF－BB group;Lane 3:PDGF－BB + Art(50 mg/L)treated group;Lane 4:PDGF－BB + Art(25 mg/L)treated group;Lane 5:PDGF－BB +Art(6.25 mg/L)treated group;Lane 6:PDGF－BB +PD98059(100 μmol/L)treated group. B:quantitative analysis of the ratio of p－ERK1/2 and cyclin D1 to GAPDH. ± s. n =6. △P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.圖2 實(shí)驗(yàn)各組HSC－T6 細(xì)胞p－ERK1/2 和cyclin D1 蛋白的表達(dá)

討 論

肝臟持續(xù)的慢性損傷導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積逐漸形成肝纖維化。肝纖維化的特征性病理改變是以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)大量沉積。HSCs 的激活是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，被看作是抗纖維化治療的主要靶細(xì)胞［4－5］。

Figure 3. EMSA analysis of AP－1 DNA binding activity of each group in HSC－T6 cells. A:autoradiography picture of EMSA;B:densitometry analysis of EMSA. Lane 1:negative control;Lane 2:control group;Lane 3:PDGF－BB group;Lane 4:PDGF－BB+Art(50 mg/L)treated group;Lane 5:PDGF－BB + Art(25 mg/L)treated group;Lane 6:PDGF－BB +Art(6.25 mg/L)treated group;Lane 7:PDGF－BB +PD98059(100 μmol/L)treated group;Lane 8:［γ－ 32P］－labeled AP－1 Oligo plus unlabeled AP－1 Oligo(competitor). ± s. n =6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.圖3 AP－1 DNA 結(jié)合活性的EMSA 分析

在肝纖維化中，PDGF－BB 是HSCs 最強(qiáng)的有絲分裂原之一，對HSCs 有著極強(qiáng)的促增殖作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Art 能有效抑制PDGF 誘導(dǎo)的HSC－T6 分泌Ⅰ型膠原。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究證實(shí)，MAPKs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，被認(rèn)為是許多信號通路的共同通道，ERK1/2 是其主要成員。ERK1/2 在肝纖維化過程中的作用已被大量實(shí)驗(yàn)證明，本課題組也證實(shí)了ERK1/2 參與了PDGF－BB 所誘導(dǎo)的HSCs 增殖［6］。ERK1/2 位于胞漿內(nèi)，被激活后迅速穿過核膜，ERK活化是將信號從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵［7］。本實(shí)驗(yàn)可以看到Art 可抑制PDGF－BB 誘導(dǎo)的HSC－T6 內(nèi)p－ERK1/2 的表達(dá)，隨Art 濃度的增加作用增強(qiáng)。而對ERK1/2 mRNA 的抑制作用不明顯，提示Art 對PDGF－BB 刺激的HSCs 增殖和Ⅰ型膠原合成的影響可能主要是抑制ERK1/2 蛋白的活化而實(shí)現(xiàn)的。

活化的ERK1/2 通過信號級聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如cyclinD1、AP－l 等調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，與細(xì)胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)前期研究表明Art 體外可阻止HSC－T6 從G0/G1期進(jìn)入S 期［3］。近年來對細(xì)胞增殖周期的研究表明［9］，細(xì)胞周期中存在2 個重要調(diào)控點(diǎn)即G1/S 和G2/M 期調(diào)控點(diǎn)，只要G1期內(nèi)的正性調(diào)節(jié)因子累積達(dá)到一定程度，周期越過G1/S交界點(diǎn)，以后細(xì)胞就不再依賴于細(xì)胞外促生長因子而順序完成整個細(xì)胞周期，因而G1/S 調(diào)控點(diǎn)是影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵。Cyclin D1 特異性地表達(dá)于細(xì)胞增殖周期的G1期，調(diào)控G0期細(xì)胞向G1期的轉(zhuǎn)化，是細(xì)胞增殖周期啟動的重要調(diào)控因子。

轉(zhuǎn)錄因子AP－1 在細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)錄時調(diào)控細(xì)胞多種基因的表達(dá)［10－11］。AP－1 由Jun 和Fos 家族成員組成，敲除c－jun 基因小鼠胚胎纖維母細(xì)胞存在嚴(yán)重增殖缺陷，cyclin D1、cyclin E 依賴的激酶活性極低，導(dǎo)致細(xì)胞不能通過G1/S 限制點(diǎn)，提示AP－1 的活化能促使細(xì)胞周期啟動［12］。有研究認(rèn)為AP－1是MAPK 信號通路的作用底物之一。ERK /MAPK主要通過轉(zhuǎn)錄因子c－Fos 參與細(xì)胞的增殖分化［10］。也有研究表明，在c－Jun/JunB 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞周期G1/S 期相關(guān)的重要靶基因cyclin D1 之間有直接聯(lián)系。利用人HeLa 細(xì)胞系研究證實(shí)，cyclin D1 啟動子上有2 個AP－1 樣結(jié)合位點(diǎn)用以激活cyclin D1 啟動子［13］，且c－Jun 和JunB 的比例決定cyclin D1 在G1期的轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞周期的平衡，最終調(diào)控cyclin D1 啟動子活性，影響其表達(dá)［14－15］，本實(shí)驗(yàn)可看到PD98059 可明顯抑制cyclin D1 基因和蛋白的表達(dá)及AP－1 與DNA 的結(jié)合活性?？梢夾P－1的活性和cyclin D1 基因和蛋白達(dá)水平受ERK1/2 通路的調(diào)控，但AP－1 和cyclin D1 之間是否也存在相互作用，還需進(jìn)一步研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Art 能有效抑制ERK1/2 蛋白的活化，同時劑量依賴性地抑制cyclin D1 基因、蛋白表達(dá)水平及AP－1 與DNA 的結(jié)合，但抑制作用不如PD98059 明顯，提示Art 對cyclin D1 和AP－1 活性的抑制作用不是直接作用，可能是通過有效抑制ERK1/2 蛋白的活化從而下調(diào)cyclin D1 表達(dá)及AP－1 與DNA 的結(jié)合活性。HSCs 的激活和表型變化涉及許多信號通路，并且各條信號通路及信號分子之間存在相互作用。實(shí)驗(yàn)中看到Art 抑制Ⅰ型膠原的作用強(qiáng)于PD98059，提示Art 對HSCs 細(xì)胞增殖的其它通路可能還有作用。

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