李友發(fā)，富昊偉，陸 強

(浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 嘉興 314016)

潮霉素B是一種氨基糖苷類抗生素，可破壞細胞中核糖體的功能。水稻中潮霉素通過單鍵細胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2的結(jié)合位點，從而抑制肽鏈的延長，破壞細胞功能，使敏感組織褐化死亡而呈現(xiàn)毒性癥狀。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)導入水稻后，使細胞具有了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)活性，從而可忍耐較高濃度的潮霉素毒性，因此，在水稻轉(zhuǎn)基因育種中，hpt基因已成為最有效的選擇基因之一。先期通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)育的Bt克螟稻都攜帶潮霉素抗性基因Hyg，在商業(yè)化生產(chǎn)競爭中處于不利地位。在嘗試通過誘變或遺傳學手段將Hyg基因與Bt基因分離的研究中，對群體中潮霉素敏感植株的快速、有效的篩選方法至關(guān)重要。有關(guān)潮霉素的處理效果除對浸種催芽［1］或離體葉片［2］有簡短報道外，也曾有用潮霉素處理水稻活體的幼苗的報道［3］。在實際應用中，我們發(fā)現(xiàn)水稻幼苗鑒別雖然有效，但仍存在較多干擾因素，特別是在應用于誘變?nèi)后w中低頻率的突變株篩選時，幼苗期的觀察效果不夠直觀。本研究中我們探索了水稻潮霉素敏感型在穗期的鑒定方法，并對其在大群體篩選試驗中的應用效果進行了研究。

1 材料與方法

參試水稻品種為克螟稻R1號與R28?？嗣綬1號系浙江大學核農(nóng)所選育的帶有hpt基因的Bt轉(zhuǎn)基因“三系”秈稻恢復系，R28系嘉興市農(nóng)科院育成的常規(guī)秈稻恢復系，不帶hpt基因。

試驗用潮霉素B為Roche公司產(chǎn)品，用清水配成50，75，100 mg·L－13種濃度水溶液。注射方法為:各處理選擇克螟稻R1號與R28各20株，當主穗處于幼穗分化八期(穗將伸而未破苞見穗階段)時，用醫(yī)用小針頭將上述濃度的潮霉素溶液注入穗苞，每個穗苞約注入0.5～1.0 mL。植株抽穗后，觀察稻穗的中毒癥狀并統(tǒng)計中毒穗粒數(shù)。噴施方法為:各處理群體40株，噴施時期為始穗期—齊穗期，此時所有植株主穗已抽出，最遲分蘗尚未抽，有較多中間穗正在抽穗過程中。用手持小噴霧器將潮霉素溶液均勻充分地噴施到穗層。植株完全抽穗后，觀察主穗的中毒癥狀并統(tǒng)計主穗的總粒數(shù)和有中毒癥狀的穗粒數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒癥狀

試驗中，克螟稻R1號無論注射還是噴施，稻穗均沒有出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)對潮霉素有很好的抗性。而R28則表現(xiàn)出不同程度的穗中毒癥狀。R28抽穗前穗苞注射的典型中毒癥狀為部分穗粒枯死(圖1中A)，這些枯死穎花呈灰白色，不開花散粉，也不能結(jié)實，或整個穗苞枯死不能抽穗(圖1中B);始穗至齊穗期噴施的典型中毒癥狀為部分穎花穎殼變黃褐色(圖1中C)，沒有出現(xiàn)穗苞枯死現(xiàn)象。由于稻穗長度20～30 cm，穗?？菟?、穗苞枯死或穎殼黃褐色，這些中毒癥狀與正常淡綠色的稻穗差異非常明顯，因此在較遠的距離就可以目測區(qū)分。

圖1 潮霉素處理水稻穗期的中毒癥狀

2.2 劑量效應

潮霉素的毒性反應存在劑量效應，主要表現(xiàn)在注射處理時，在50，75，100 mg·L－1處理下，枯死穗粒數(shù)分別為26.3%，27.9%，32.7%，呈增加趨勢;各20株注射植株中分別有1，2，3株植株穗苞枯死，也隨著劑量增加而增加。噴施試驗結(jié)果(表1)顯示，潮霉素中毒癥狀表現(xiàn)較注射不明顯，主要表現(xiàn)不是枯死，而是穎殼變黃褐色或褐色，這些呈黃褐色的穎花仍能開花散粉，也能正常結(jié)實。這類褐色穎殼的穗粒數(shù)分別為9.70%，14.6%，16.2%，也隨著劑量的增加而增加。

表1 水稻R28注射和噴施潮霉素中毒的劑量效應

3 小結(jié)與討論

本試驗是在我們對水稻活體幼苗潮霉素敏感性研究的基礎(chǔ)上，進一步發(fā)展的對水稻活體穗期潮霉素敏感性的研究。研究表明，抽穗前穗苞注射潮霉素的，其毒性癥狀主要為穗粒枯死或穗苞枯死;穗期噴施則表現(xiàn)為穎殼黃褐色但仍能正常開花結(jié)實。其表現(xiàn)的毒性癥狀均較葉片斑點狀毒性癥狀易區(qū)分。在對12萬株誘變M2大群體篩選中進一步證明該毒性癥狀的可應用性。

先期報道中提出用潮霉素噴施水稻幼苗葉片的方法來鑒別敏感型植株［3］，但在實際應用中我們發(fā)現(xiàn)該方法雖然有效，但存在較多干擾因素，主要表現(xiàn)為:因幼苗很小且秧田期播種稠密，噴施時易于漏噴幼苗;幼苗處于快速生長過程中，噴施后7～10 d即會有1～2張新葉出現(xiàn)，這些新葉是不會出現(xiàn)斑點的，這對觀察造成干擾;最主要的干擾是水稻葉片的生理性病斑，水稻幼苗在秧苗期會出現(xiàn)各種黃褐斑，如由銹病引起、缺微量元素引起等，更對鑒別造成很大干擾。特別是作為誘變育種低頻率的突變性狀的篩選方法，幼苗期觀察效果不夠直觀的缺點更加明顯。而穗期觀察，由于水稻的穗長一般有20 cm左右，且穗粒枯死或黃褐斑與正常稻穗的顏色的區(qū)分是十分明顯的。穗期噴施篩選效果的高效直觀，在誘變突變體的篩選方面具有明顯優(yōu)勢。

從篩選成本來看，幼苗期篩選在潮霉素用量方面顯然節(jié)省很多。如同樣的12萬株群體，幼苗期處理，估算只需0.5～1.0 g的潮霉素，而穗期噴施，約需150 kg藥液，潮霉素實際用量約為15 g，但如果采用雙叢或多叢移栽的方式，則同樣的群體，可成倍減少潮霉素的用量。

標準基因是遺傳工程中的重要工具基因，一般都與目的基因以連鎖的方式構(gòu)建在同一T-DNA上。但是，在獲得轉(zhuǎn)基因植株后，從應用角度講它們就成了多余的甚至不受歡迎的部分，特別是在轉(zhuǎn)基因安全性評價中，對hpt標記基因安全性的憂慮是目前我國轉(zhuǎn)基因安全性評價中的一個重點［4］。雖然通過無標記轉(zhuǎn)基因植物(marker-free transgenic plants，MFTP)培育技術(shù)已可獲得不帶htp標記基因的轉(zhuǎn)基因材料［5－8］，但這些技術(shù)只適用于新的MFTP的培育，無法應用于已經(jīng)育成并具有重要應用價值的轉(zhuǎn)基因植物中標記基因的剔除。如克螟稻及其衍生親本［9－10］，由于帶有 htp基因，已成為獲得安全證書的一種制約。通過人工理化誘變，將現(xiàn)有的有重大應用價值轉(zhuǎn)基因材料中的htp基因剔除或部分片段失活，則可在一定程度上排除這種安全性顧慮。

［1］王忠華，舒慶堯，賀華龍，等．Bt轉(zhuǎn)基因水稻對抗生素反應的初步研究［J］．植物生理學通迅，2001，37(2):111－113．

［2］Wang M B，Peter M，Waterhouse．A rapid and simple method of assaying plantstransformed with hygromycin and HPT resistance genes［J］．PIantMolecularBiology Reporter，1997，15:209－215．

［3］王彩霞，吳殿星，沈圣泉，等．轉(zhuǎn)基因及常規(guī)水稻幼苗對潮霉素敏感性的研究［J］．核農(nóng)學報，2005，19(3):168－171．

［4］應丹平，張恒木，陳劍平，等．提高轉(zhuǎn)基因植物安全性的策略［J］．浙江農(nóng)業(yè)學報，2007，19(2):130－134．

［5］Puchta H．Marker-free transgenic plants［J］．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，74:123－134．

［6］Subha S，Jacob，K V．Generation of selection marker-free transgenic plants by cotransformation of a cointegrate vector TDNA and a binary vectorT-DNA in one Agrobacterium tumefaciens strain［J］．PlantScience，2002，163:801－806．

［7］OlivierC，Christophe S，Christophe B J．Transposonmediated generation ofT-DNA and markerfreericeplants expressing a Btendotoxin gene［J］．Molecular Breeding，2002，10(3):165－180．

［8］Matsunaga E，Sugita K，Ebinuma H．A sexual production of selectable marker-free transgenic woody plants，vegetatively propagated species［J］．Molecular Breeding，2002，10:95－106．

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［10］吳剛，崔海瑞，舒慶堯，等．GUS組織化學染色法:一種快速篩選抗二化螟轉(zhuǎn) Bt以 crylAb基因水稻的方法［J］．浙江大學學報:農(nóng)業(yè)與生命科學版，2000，26(2):141－143．