(無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫 214000)

據(jù)美國(guó)衛(wèi)生部門統(tǒng)計(jì)顯示，因肝癌而死亡的人數(shù)位居腫瘤導(dǎo)致死亡人數(shù)的第二位。肝癌的早期癥狀不明顯［1，2］，因此尋找特異性的腫瘤表面標(biāo)志及分子靶點(diǎn)具有非常重要的意義。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤始動(dòng)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥的罪魁禍?zhǔn)?。?011年初至今，我們檢測(cè)了肝癌干細(xì)胞及肝癌普通細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)差異，探討肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為特點(diǎn)，旨在為其鑒定分選及其生物學(xué)特征的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞株MHCC-97H(購自中科院上海細(xì)胞庫)，細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM-F12培養(yǎng)基及胰蛋白酶(購自美國(guó)Thremo Fisher公司)，小鼠抗人 CD133Ig，小鼠抗人 Ki67Ig，小鼠抗人MMP9Ig，小鼠抗人MDR1Ig(購自武漢博士德生物工程有限公司)。熒光顯微鏡。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)體系 ①普通培養(yǎng)體系:將MHCC-97H細(xì)胞培養(yǎng)于含l0%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中。②干細(xì)胞克隆增殖體系:培養(yǎng)于普通培養(yǎng)體系中的MHCC-97H細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，將其培養(yǎng)于含10 μg/L堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、20 μg/L 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、5 μg/L 胰島素、2.75 g/L 轉(zhuǎn)鐵蛋白、2.75 μg/L 硒的無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中，每10天換液1次。將相同來源的MHCC-97H細(xì)胞系分別培養(yǎng)于兩種培養(yǎng)體系中，放人含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱，2 d換液1次。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)采用免疫熒光法測(cè)定。取肝癌干細(xì)胞球及對(duì)數(shù)期肝癌細(xì)胞，分別接種于含有5 mL相應(yīng)培養(yǎng)體系的24孔板中，培養(yǎng)12 h;4%多聚甲醛溶液常溫下固定細(xì)胞克隆1 h;棄固定液，用PBS漂洗3次，每次15 min;用封閉液于37℃下封閉l h;棄廢液，用PBST(0.02 mol/L的PBS中加入0.02%Triton100)漂洗3次，每次15 min;棄廢液，加入一抗，37℃下孵育1 h;棄廢液，用PBST漂洗3次，每次15 min;棄廢液，加入FITC標(biāo)記二抗孵育2 h及Hoechst 33342，37℃下避光孵育30 min;棄廢液，用PBST避光漂洗3次，每次10 min;50%丙三醇封片。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及細(xì)胞表面蛋白CD133、細(xì)胞核相關(guān)抗原(Ki67)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、多藥耐藥蛋白1(MDR1)表達(dá)。

1.3.2 腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Westernblot法測(cè)定。收集培養(yǎng)10 d的兩組細(xì)胞，放入裂解緩沖液中裂解，用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，TBS洗 3次，將膜放入一抗中(1∶500稀釋)，4℃過夜。TTBS洗3次，將膜放入二抗(1∶500稀釋)中，室溫孵育1～2 h，用TTBS洗3次，最后用TBS洗膜1次，放入NBT/BC IP顯色液中避光顯色，直至染色出現(xiàn)，終止反應(yīng)。將蛋白印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件，對(duì)蛋白帶進(jìn)行灰度值分析。以上試驗(yàn)步驟重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MHCC-97H生長(zhǎng)狀況 干細(xì)胞克隆增殖體系中部分細(xì)胞不增殖，大部分細(xì)胞增殖為半貼壁的細(xì)胞球(圖-1A)，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，懸浮細(xì)胞球體積逐漸增大，經(jīng)胰酶消化為單細(xì)胞后可再次形成細(xì)胞球。在普通培養(yǎng)體系中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)(圖-1B)。

2.2 細(xì)胞表面相關(guān)蛋白表達(dá) 腫瘤干細(xì)胞表面高表達(dá) CD133、MDR1、MMP9，而普通細(xì)胞表面未見CD133、MDR1表達(dá)，MMP9呈弱表達(dá)。肝癌干細(xì)胞及普通細(xì)胞表面Ki67均呈強(qiáng)表達(dá)，干細(xì)胞Ki67表達(dá)強(qiáng)于普通細(xì)胞(圖2)。

圖1 肝癌干細(xì)胞與普通細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)

圖2 肝癌干細(xì)胞和普通細(xì)胞表面相關(guān)蛋白表達(dá)(免疫熒光法)

2.3 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá) 肝癌干細(xì)胞中CD133、MMP9、MDR1呈高表達(dá)，普通肝癌細(xì)胞中未見表達(dá)，兩組比較有顯著性差異，P＜0.05。Ki67在兩種細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，普通肝癌細(xì)胞表達(dá)量高于肝癌細(xì)胞，但無顯著性差異。

圖3 肝癌干細(xì)胞與普通細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)(Western-blot法)

3 討論

近年來研究顯示，腫瘤組織中存在一群少量的腫瘤干細(xì)胞(在血液系統(tǒng)惡性腫瘤和某些實(shí)體瘤中已得到證實(shí))［3］。該群細(xì)胞具有自我復(fù)制，對(duì)放療和化療耐受等特征，被認(rèn)為是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥的基礎(chǔ)［4］;可能是導(dǎo)致肝癌早期診斷率低，復(fù)發(fā)率高，耐藥性強(qiáng)的最終原因。

目前分離腫瘤干細(xì)胞通常采用側(cè)群細(xì)胞分選法、流式細(xì)胞分選法及無血清懸浮培養(yǎng)法［5］。本研究采用無血清懸浮培養(yǎng)法從肝癌細(xì)胞MHCC-97H系中分離出干細(xì)胞，該群細(xì)胞呈懸浮半貼壁生長(zhǎng)，且體外連續(xù)傳代10代始終能保持成球的特征;當(dāng)轉(zhuǎn)換成血清培養(yǎng)時(shí)，干細(xì)胞球細(xì)胞能貼壁生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，CD133是腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物［6］，本研究中腫瘤干細(xì)胞表面CD133呈高表達(dá)，既證實(shí)該種蛋白可作為肝癌干細(xì)胞分選的標(biāo)志物，亦證實(shí)本研究無血清培養(yǎng)的細(xì)胞球?yàn)楦伟└杉?xì)胞。

MDR1是一種包括1280個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為17000的跨膜磷脂糖蛋白，具有能量依賴性藥泵作用。其功能是能主動(dòng)將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)化療藥物逆濃度泵出細(xì)胞，降低細(xì)胞毒性，并使細(xì)胞內(nèi)有效化療藥物濃度下降，從而導(dǎo)致耐藥。MDR1介導(dǎo)的腫瘤耐藥是化療失敗的主要原因之一。MDR1在白血病干細(xì)胞上的表達(dá)已有大量報(bào)道［7］。但在肝癌細(xì)胞是否表達(dá)鮮見報(bào)道。本研究顯示MDR1在肝癌干細(xì)胞呈高表達(dá)，而在肝癌非干細(xì)胞未見表達(dá)，因此筆者認(rèn)為，肝癌干細(xì)胞表達(dá)的MDR1是介導(dǎo)肝癌發(fā)生耐藥的主要機(jī)制之一;作為肝癌干細(xì)胞的特異性膜表達(dá)蛋白，MDR1可作為腫瘤干細(xì)胞分選的分子標(biāo)志之一。

MMP9是MMP中分子量最大的酶，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以酶原的形式分泌。其分泌到胞外后一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁的基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移;另一方面通過毛細(xì)血管內(nèi)生、新生血管生成促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP是高度保守的一類酶，可特異性的降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，是腫瘤細(xì)胞向瘤灶周圍侵襲性生長(zhǎng)的關(guān)鍵酶［8］。本研究發(fā)現(xiàn)MMP9在肝癌干細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)，而肝癌非干細(xì)胞未見明顯表達(dá)，據(jù)此推測(cè)，其介導(dǎo)肝癌轉(zhuǎn)移的主要原因是肝癌干細(xì)胞分泌MMP9;激活的MMP9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁的基底膜，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Ki67是一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，與細(xì)胞的有絲分裂有關(guān)，其存在于細(xì)胞周期G1后期及S、G2、M期，與細(xì)胞的增殖高度有關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌干細(xì)胞及非干細(xì)胞內(nèi)均存在Ki67高表達(dá)，說明這兩種細(xì)胞都具有很強(qiáng)的增殖能力。

總之，肝癌組織中存在著一群腫瘤干細(xì)胞，該群細(xì)胞是介導(dǎo)腫瘤發(fā)生耐藥、轉(zhuǎn)移、增殖的主導(dǎo)因素。MDR1為肝癌干細(xì)胞的特異性細(xì)胞表面抗原，可作為其分選、簽定的有效分子標(biāo)志物。聯(lián)合多種指標(biāo)簽定、篩選出的肝癌干細(xì)胞將對(duì)惡性程度極高的腫瘤的治療產(chǎn)生影響。

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