華秀峰 ，王延偉，劉芙君，靳少華，孟曉梅，李華峰，王海燕，李建遠

(1煙臺毓璜頂醫(yī)院，山東煙臺 264000)

流行病學調(diào)查顯示，近年來我國糖尿病患病率逐漸升高［1］。1型糖尿病需終生胰島素治療，50%以上的2型糖尿病患者患病5年后需行胰島素治療，但外源性胰島素療效并不十分理想。近年來胰島移植治療糖尿病獲得成功［2］，但需兩個尸體胰腺方能滿足一次胰島移植所需的細胞量，巨大的社會需求與尸源性胰島供體不足迫切要求臨床探尋新的胰島細胞來源。胚胎干細胞(ESs)來源于早期胚胎內(nèi)細胞團，是真正的全能干細胞，可發(fā)育成包含內(nèi)胚層、中胚層及外胚層在內(nèi)的所有類型的組織器官，通過體外定向誘導，小鼠及人ESs已成功分化為胰島素分泌細胞［3，4］，為糖尿病的細胞替代治療帶來了新的思路。為探討體外高效誘導hESs定向分化為胰島細胞的可行性，優(yōu)化各階段細胞培養(yǎng)條件，提高胰島細胞的分化效率及功能，為糖尿病的細胞替代治療提供足量的成熟胰島細胞，我們于2011年3月～2012年3月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑 hESCs細胞系來源于山東省干細胞工程技術(shù)研究中心自行建立的符合國際標準的IVF來源的人胚胎干細胞系YT1、YT2及YT3［5］。活化素 A、渥曼青霉素、RA、NOGGIN、bFGF、EGF、胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒復合物(ITS)、尼克酰胺、唾液素-4、BMP4、二脒基苯基吲哚(DAPI)、雙硫腙(Dithizone)及熒光二抗購自 SIGMA公司;培養(yǎng)基DMEM/F12及 F12/IMDM購自GIBCO公司;胰島素、胰高糖素、PDX-1、C肽、Glut-2抗體購自CHEMICON公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將hESCs置于含有10 ng/mL的bFGF及20%KSR(KnockOut serum replacement，knockout血清替代品)的 DMEM/F12中培養(yǎng)，于經(jīng)絲裂霉素處理的飼養(yǎng)層上擴增，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液1次。

1.2.2 體外hESCs定向誘導分化 采用200 U/mL的膠原酶Ⅳ消化hESCs團為較松散的小細胞團，置于基質(zhì)膠Matrigel包被的培養(yǎng)板中，達到60%融合時分為三階段誘導hESCs定向分化為胰島細胞。第一階段:采用含100 ng/mL活化素 A、1 μM 的渥曼青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)4 d，分化形成定型內(nèi)胚層;第二階段:hESCs于含有2 μM RA、20 ng/mL bFGF和50 ng/mL NOGGIN的F12/IMDM培養(yǎng)4 d，誘導胰腺細胞定向分化;再予50 ng/mL的EGF培養(yǎng)5 d擴增胰腺祖細胞;第三階段:采用含1%ITS、10 ng/mL bFGF、10 mM 尼克酰胺、50 ng/mL唾液素-4及10 ng/mL BMP4的DMEM/F12中培養(yǎng)7～9 d，促進成熟胰島細胞形成。

1.2.3 分化細胞鑒定 倒置顯微鏡下觀察各期細胞形態(tài)變化，將誘導4、8、13、20及22 d的細胞分別行PDX-1、胰高糖素、胰島素、C肽、glut-2共聚焦顯微鏡免疫熒光鑒定，參照試劑盒說明書操作。一抗4℃孵育過夜，次日二抗37℃孵育30 min，磷酸甘油封片，共聚焦顯微鏡觀察相關(guān)抗體熒光表達。

1.2.4 胰島素及C肽陽性細胞表達測定 分別將誘導1、12、22 d的細胞制成單細胞懸液，4%多聚甲醛溶液固定 15 min，PBS清洗，0.3%Triton X-100處理，0.5%牛血清白蛋白封閉，加一抗孵育，F(xiàn)ITC標記熒光二抗，室溫下避光孵育30 min，PBS清洗，細胞重懸，流式細胞儀檢測胰島素、C肽陽性細胞表達。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學變化 倒置顯微鏡下觀察未分化hESCs呈集落生長，集落分散后懸浮培養(yǎng)生成球形擬胚體(圖1A)，擬胚體于Matrigel膠上第1天貼壁生長(圖1B)，第4天細胞逐漸伸展爬出細胞集落，呈單層生長，體積開始增大(圖1C);第8天細胞開始回縮，體積變小、細胞變圓(圖1D);加入EGF后于第13天細胞增殖旺盛(圖1E);第20天細胞形成較均一呈規(guī)則圓形的胰島細胞(圖1F)。

2.2 hESs分化各階段細胞熒光表達 誘導分化14 d細胞出現(xiàn)胰高糖素綠色熒光陽性表達(圖2A);誘導分化20天出現(xiàn)綠色C肽和紅色PDX-1的共表達(圖2DEF);誘導分化22 d形成的成熟胰島細胞出現(xiàn)綠色glut-2(圖2B)和綠色胰島素(圖2C)陽性表達。

2.3 將誘導1 d、12 d、22 d細胞進行流式細胞檢測胰島素及C肽陽性細胞表達(圖3)，分化22 d胰島素陽性細胞占17.1%，C肽陽性細胞占3.8%。

圖1 hESs向胰島細胞分化各階段細胞形態(tài)變化

圖2 hESs分化各階段細胞熒光表達

3 討論

圖3 hESs誘導形成的胰島細胞流式細胞圖

胚胎胰腺發(fā)育是極其復雜的過程，通過模擬體內(nèi)胰腺發(fā)育過程，近年國內(nèi)外多個研究團隊逐漸探索出多套體外多步驟誘導胚胎干細胞分化為胰島細胞的方法，經(jīng)典的五步誘導法分別經(jīng)過定型內(nèi)胚層、原始前腸、后前腸、胰腺內(nèi)胚層及胰腺祖細胞、胰島細胞等五個階段，最終形成的成熟胰島細胞的胰島素分泌能力低于原生胰島細胞，功能相當于胎兒時期胰島，缺乏葡萄糖依賴的胰島素釋放反應，胰島細胞分化效率僅為7.3%［6］。本研究改良人胚胎干細胞誘導胰島細胞分化過程，由復雜的五階段改進為簡單高效的三階段法［7］，先期工作比較了各種誘導分化方法的優(yōu)劣所在，篩選出有效的胰島細胞誘導分化方法，經(jīng)流式細胞分析最終形成的成熟胰島細胞分化率達到17.1%，共表達C肽和PDX-1是分化胰島細胞成熟的標志，分化細胞表達胰島素、胰高糖素、C肽、glut-2提示胰島細胞功能成熟。

EGF及其受體表達貫穿于整個胚胎胰腺發(fā)育過程，EGF受體敲除不能發(fā)育生成正常胰腺。EGF是成纖維細胞及上皮細胞等各種細胞增殖所需的重要的細胞因子，聯(lián)合使用EGF及胃泌素可以恢復STZ誘導破壞的小鼠胰島β細胞功能［8］。我們在以往研究中發(fā)現(xiàn)，EGF可促進胎兒骨髓間充質(zhì)干細胞、胎兒胰腺干細胞分化為胰島細胞［9，10］，本研究中發(fā)現(xiàn)EGF可促進胰腺祖細胞的擴增。在糖尿病動物模型中發(fā)現(xiàn)EGF及EGF受體水平下降，體外實驗還發(fā)現(xiàn)EGF水平與胰島素分泌密切相關(guān)，EGF及其受體的進一步研究將為糖尿病的細胞替代治療帶來新的思路。

綜上所述，本研究構(gòu)建了高效的三階段誘導人胚胎干細胞分化為成熟胰島細胞的方法，為成熟胰島細胞的體內(nèi)移植研究提供了實驗依據(jù)。

［1］《中國糖尿病防治指南2010版》.北京大學醫(yī)學出版社.北京.2011:1.

［2］Shapiro AMJ，Lakey JRT，Ryan EA，et al.Islet transplantation in seven patients with type1 diabetes mellitus using a glucocorticoidfree immunosuppressive regimen［J］.N Engl J Med，2000，343(4):230-238.

［3］Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islet［J］.Science，2001，292(5520):1389-1394.

［4］Assady S，Maor G，Amit M，et al.Insulin production by human embryonic stem cells［J］.Diabetes，2001，50(8):1691-1697.

［5］Wang Y，Xu C，Wang H，et al.Efficient derivation of human embryonic stem cell lines from discarded embryos through increases in the concentration of basic fibroblast growth factor［J］.Hum Cell，2012，25(1):16-23.

［6］D'Amour KA，Bang AG，Eliazer S，et al.Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells［J］.Nat Biotechnol，2006，24(11):1392-1401.

［7］Donghui Zhang，Wei Jiang，Meng Liu，et al.Highly effcient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells［J］.Cell Research，2009，19(4):429-438.

［8］Brand SJ，Tagerud S，Lambert P，et al.Pharmacological treatment of chronic diabetes by stimulating pancreatic beta-cell regeneration with systemic co-administration of EGF and gastrin［J］.Pharmacol Toxicol，2002，91(6):414-420.

［9］華秀峰，王瑋，王海燕，等.胎兒骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向誘導分化為胰島樣細胞［J］.中國醫(yī)師雜志，2006，8(10):1297-1299.

［10］Xiufeng Hua，Yanwei Wang，Peiwen Lian，et al.Differentiation of fetal pancreatic stem cells into neuron-like and islet-like cells in vitro［J］.Neural Regen Res，2012，7(7):506-510.