劉建業(yè)（山西省兒童醫(yī)院藥劑科，山西 太原 030013）

祛腐再生膏為醫(yī)院自制中藥制劑，由當(dāng)歸、白芷、紫草等6味藥材組成，具有活血止痛、祛腐生肌的功效，用于瘡瘍潰爛、膿腐不脫、疼痛不止、新肌難生者。本品原標(biāo)準(zhǔn)只收載了當(dāng)歸的TLC鑒別，缺少科學(xué)的定性、定量標(biāo)準(zhǔn)，不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。為有效地控制祛腐再生膏的質(zhì)量，按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)批件》備注項(xiàng)下的要求，我們對(duì)其制劑中的當(dāng)歸、白芷進(jìn)行定性分析，采用高效液相色譜法對(duì)藁本內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀（1525 泵、2487 紫外檢測(cè)器）；CPA225D電子天平（德國(guó)賽多利斯）。藁本內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào) 110756-200110）；祛腐再生膏（批號(hào)110701，110702，110703，111201，111202，111203）及陰性樣品均自制。甲醇、三氟乙酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

圖1 當(dāng)歸薄層色譜圖1-陰性；2-祛腐再生膏；3-當(dāng)歸對(duì)照藥材Fig 1 TLC of Radix Angelicae Sinensis1-negative sample without Radix Angelicae Sinensis; 2 -Qufuzaisheng ointment; 3-Radix Angelicae Sinensis

2.1.1 當(dāng)歸的鑒別 取本品10 g，加甲醇30 mL，加熱使溶解，超聲30 min，4 ℃冷藏4 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL，超聲使溶解，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國(guó)藥典》一部 附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10∶1∶0.1）為展開劑，展開，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖1。

2.1.2 白芷的鑒別 取本品10 g，加甲醇30 mL，加熱攪拌使溶解，超聲30 min，4 ℃冷藏4 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右颐? mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芷對(duì)照藥材2 g，加麻油20 mL，加熱至藥材成黃褐色，趁熱濾過，放冷，加甲醇20 mL，置分液漏斗中，分取上層液，蒸干，殘?jiān)右颐? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國(guó)藥典》一部 附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚（1∶4）為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱10 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，見圖2。

圖2 白芷薄層色譜圖1-陰性；2-白芷對(duì)照藥材；3-祛腐再生膏Fig 2 TLC of Radix Angelicae Dahuricae1-negative sample without Radix Angelicae Dahuricae; 2-Radix Angelicae Dahuricae; 3-Qufuzaisheng ointment

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%三氟乙酸水（58∶42）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液的制備：取藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20.3 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物約10 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，加水100 mL，連接揮發(fā)油提取器，自提取器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯3 mL，加熱回流1 h，放冷，分取乙酸乙酯層，揮發(fā)油提取器用甲醇適量洗滌，合并乙酸乙酯和甲醇液，通過鋪有0.5 g無水硫酸鈉的漏斗，用甲醇適量洗滌數(shù)次，合并于5 mL的容量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。（3）陰性樣品溶液的制備：按處方比例，按照祛腐再生膏的制備工藝制備缺當(dāng)歸的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，供試品中藁本內(nèi)酯與相鄰成分基本分離，且陰性對(duì)照無干擾，見圖3。

圖3 HPLC的色譜圖A-對(duì)照品溶液；B-祛腐再生膏；C-陰性樣品溶液；1-藁本內(nèi)酯Fig 3 HPLC chromatogramsA-reference substance; B-Qufuzaisheng ointment; C-negative sample; 1-ligustilid

2.2.4 方法學(xué)考察 （1）線性范圍：分別精密吸取濃度為20.3 μg·mL-1的藁本內(nèi)酯對(duì)照溶液2，5，10，20，50，75，100 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得回歸方程Y= 2.17×106X＋3 026.6，r=0.999 8，結(jié)果表明，在0.040 6～2.03 μg范圍內(nèi)，藁本內(nèi)酯峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

（2）精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為0.72%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取本品，照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算得藁本內(nèi)酯的平均含量為0.015 3 mg·g-1，RSD為1.43%，表明該法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液分別于0，2，4，8，12 h進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，測(cè)定結(jié)果，結(jié)果藁本內(nèi)酯在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為1.63%。

（5）回收率實(shí)驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品9份（藁本內(nèi)酯的含量為0.015 1 mg·g-1），每份約5 g，精密稱定，按表1精密加入濃度為20.3 μg·mL-1藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液適量，制備成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，平均回收率為98.26%，RSD = 2.48%（n= 9），結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果.n = 9Tab 1 Results of recovery.n = 9

2.2.5 樣品含量測(cè)定 取6批祛腐再生膏（批號(hào)為110701，110702，110703，111201，111202，111203），按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備各供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 本研究增加了白芷的TLC鑒別；修訂了當(dāng)歸的TLC鑒別；增加了當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的HPLC含量測(cè)定。研究中也考察了紫草的TLC鑒別，但因紫草在方中用量較少，分離度不好，陰性有干擾，未收錄到文中。

表2 祛腐再生膏中藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定結(jié)果.n = 3Tab 2 Content determination of ligustilid in Qufuzaisheng ointment.n = 3

3.2 由于藁本內(nèi)酯為揮發(fā)性成分，性質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生異構(gòu)化[1]，且本品為軟膏劑，為保證提取率及藁本內(nèi)酯的穩(wěn)定性，我們分別采用回流提取、超聲提取、揮發(fā)油提取法，并對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，采用揮發(fā)油提取器提取45 min，對(duì)藁本內(nèi)酯的提取效果最好。我們比較了在甲醇-三氟乙酸水[2]、乙腈-磷酸水[3]、甲醇-乙腈-磷酸水[4]、甲醇-異丙醇水[5]等不同溶液系統(tǒng)中的色譜分離能力，結(jié)果流動(dòng)相為甲醇-0.05%三氟乙酸水時(shí)可得到較好的色譜分離效果。

3.3 本實(shí)驗(yàn)中的藁本內(nèi)酯回收率偏低且RSD相對(duì)較大，可能是由于其溶液在室溫下不穩(wěn)定易發(fā)生異構(gòu)化所致，而其在揮發(fā)油中基本穩(wěn)定，不會(huì)出現(xiàn)純品的異構(gòu)化反應(yīng)，這可能是揮發(fā)油中含有一定量的藁本內(nèi)酯異構(gòu)化產(chǎn)物，使異構(gòu)化反應(yīng)趨于平衡所致[1]。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，藁本內(nèi)酯在甲醇中穩(wěn)定性良好[5]，故本文采用揮發(fā)油提取器提取，以甲醇作為溶劑及流動(dòng)相，提高了外標(biāo)法定量測(cè)定中藥制劑中藁本內(nèi)酯含量的準(zhǔn)確性。同時(shí)，本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，本品中藁本內(nèi)酯的量會(huì)降低，這可能與其本身不穩(wěn)定且具有揮發(fā)性有關(guān)。因此，建議在本品的儲(chǔ)藏過程中，盡量低溫避光保存，且不宜貯存時(shí)間過長(zhǎng)。

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