杜亞楠，涂曉嶸，胡志斌，李慶蒙，魏賽金，2*

(1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/南昌市發(fā)酵應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045;2．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

靈芝(Ganoderma lucidum)是名貴藥用真菌，自古被譽(yù)為延年益壽之佳品，功可補(bǔ)氣益血，養(yǎng)血安神、臨床應(yīng)用非常廣泛［1］。硒是人體必需的微量營養(yǎng)元素之一，缺硒會(huì)直接導(dǎo)致人體免疫能力下降。臨床醫(yī)學(xué)證明，威脅人類健康和生命的四十多種疾病都與人體缺硒有關(guān)［2－5］。

本文以大豆為原材料接種富硒靈芝液體種子，探索大豆固體發(fā)酵產(chǎn)氨基酸新工藝，為開發(fā)大豆既富含游離氨基酸，又含靈芝多糖及微量有機(jī)硒的高營養(yǎng)價(jià)值食品提供了新思路。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種 靈芝730(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地提供)。

1．1．2 主要試劑與儀器 抗壞血酸、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液、茚三酮試劑、亞硒酸鈉，以上均為分析純。722型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)等。

1．1．3 供試培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基［6］;一級液體種子培養(yǎng)基:去皮土豆300 g，蔗糖20 g，酵母膏 2．0 g，大豆蛋白胨 5．0 g，KH2PO41．0 g，MgSO4·7H2O 2．0 g，pH 5．5，蒸餾水 1 000 mL;二級液體種培養(yǎng)基:蔗糖80 g，大豆蛋白胨5．0 g，酵母膏5．0 g，KH2PO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl25 g，土豆200 g，pH 5．5，蒸餾水1 000 mL;固體發(fā)酵培養(yǎng)基［7］:浸泡過夜的大豆洗凈，瀝干水分，在250 mL三角瓶中分別盛不同重量的浸泡過夜的大豆，121℃滅菌30 min，備用。

1．2 方法

1．2．1 菌種的活化［8］取實(shí)驗(yàn)室冰箱保存的靈芝菌種，接種于PDA斜面，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，即得活化斜面菌種。

1．2．2 靈芝液體菌種的制備 從活化好的斜面中挖取0．5 cm2左右的菌塊1～2塊，接入一級液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL。30℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d［9］。將培養(yǎng)好的一級種子液按10%的接種量接種到亞硒酸鈉終濃度為300 μg/mL的二級液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL，在30℃ 180 r/min培養(yǎng)4 d，即得富硒靈芝種子液。

1．2．3 單因素試驗(yàn)［10］(1)培養(yǎng)溫度試驗(yàn)。取40 g/瓶的大豆固體發(fā)酵培養(yǎng)基15瓶，分別接種靈芝液體菌種，接種量10%(v/w)，分別置于26，28，30，32，34℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每種溫度處理重復(fù)3瓶。間歇搖勻，使靈芝菌絲體生長均勻。培養(yǎng)7 d后取培養(yǎng)料烘干檢測游離氨基酸總量。

(2)接種量試驗(yàn)。取40 g/瓶的大豆固體發(fā)酵培養(yǎng)基15瓶，分別接種靈芝液體菌種，接種量(v/w)分別為5%、10%、15%、20%、25%、30℃恒溫培養(yǎng)，每種試驗(yàn)處理重復(fù)3瓶。間歇搖勻。培養(yǎng)7 d后取培養(yǎng)料烘干檢測游離氨基酸總量。

(3)培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)。取40 g/瓶的大豆固體發(fā)酵培養(yǎng)基18瓶，分別接種靈芝液體菌種，接種量10%(v/w)，置于30℃恒溫培養(yǎng)，每種試驗(yàn)處理重復(fù)3瓶。分別培養(yǎng)至3，4，5，6，7，8 d后取培養(yǎng)料烘干檢測游離氨基酸總量。

(4)裝量試驗(yàn)。分別取裝量30 g/瓶、40 g/瓶、50 g/瓶、60 g/瓶、70 g/瓶的大豆固體發(fā)酵培養(yǎng)基各3瓶，分別接種靈芝液體菌種，接種量(v/w)分別為10%，置培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)。間歇搖勻。培養(yǎng)7 d后取培養(yǎng)料烘干檢測游離氨基酸總量。

1．2．4 中心組合試驗(yàn) 根據(jù)Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理［11］，分別以不同接種量、不同培養(yǎng)溫度和不同培養(yǎng)時(shí)間三因素三水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以游離氨基酸含量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，探素大豆接種靈芝液體種子進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)游離氨基酸的較佳培養(yǎng)工藝條件。

1．2．5 游離氨基酸總量的測定 將發(fā)酵產(chǎn)物按標(biāo)記倒入平皿中，50℃干燥至恒重，稱取干燥樣品0．25 g于研缽中，加入12．5 mL體積分?jǐn)?shù)為10%醋酸溶液研磨成勻漿，過濾，濾液加蒸餾水定容至250 mL，保存?zhèn)溆茫?2］。采用茚三酮法［13］，測定樣品中游離氨基酸的含量。

1．2．6 有機(jī)硒含量測定 依據(jù)參考文獻(xiàn)［8］的方法測定大豆干粉和靈芝固態(tài)發(fā)酵物中有機(jī)硒的含量。1．2．7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

大豆固體培養(yǎng)基接種液體靈芝種子液，分別在不同溫度、不同接種量、大豆不同裝量和不同培養(yǎng)時(shí)

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig．1 The result of single factor experiment

間進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)對游離氨基酸總量影響的單因素試驗(yàn)結(jié)果分別見圖1(a)、圖1(b)、圖1(c)和圖1(d)。

由圖1(a)可知:在溫度30℃時(shí)，大豆固體培養(yǎng)基接種液體靈芝種子液進(jìn)行固體發(fā)酵7 d后，發(fā)酵大豆中的游離氨基酸的產(chǎn)量高達(dá)223．0 mg/100 g。

由圖1(b)可知:大豆固體培養(yǎng)基接種10%液體靈芝種子液進(jìn)行固體發(fā)酵為較適宜的接種量，固體發(fā)酵7 d后，發(fā)酵大豆中的游離氨基酸的產(chǎn)量高達(dá)238．2 mg/100 g。

由圖1(c)可知:大豆固體培養(yǎng)基接種10%液體靈芝種子液進(jìn)行固體發(fā)酵6 d后，發(fā)酵大豆中的游離氨基酸的產(chǎn)量高達(dá)254．4 mg/100g。

由圖1(d)可知:大豆培養(yǎng)基在250 mL三角瓶中的不同裝量，接種10%液體靈芝種子液進(jìn)行固體發(fā)酵7 d后，發(fā)酵大豆中的游離氨基酸的產(chǎn)量差異不顯著。

在各個(gè)水平靈芝菌絲體的生長變化不大，游離氨基酸的含量比較接近，差異不明顯。由此可知在接種量一定的情況下，裝瓶量對靈芝固態(tài)發(fā)酵的影響不顯著。

2．2 采用響應(yīng)面分析法對靈芝大豆固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2．2．1 響應(yīng)面分析因素的選取 根據(jù)Box－Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度對游離氨基酸含量影響顯著的3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab．1 Factors and levels of experiment of Response Surface Analysis

2．2．2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 以接種量X1、培養(yǎng)時(shí)間X2、培養(yǎng)溫度X3為自變量，以游離氨基酸的含量為響應(yīng)值(Y1)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Observed and estimated values for different levels of experimental design

2．2．3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 對表2試驗(yàn)結(jié)果通過SAS軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型:Y1=276．372 3+6．238 95X1+9．233 85X2－ 8．498 3X3－11．052 62X1X1－4．484 7X1X2+5．003 4X1X3－ 7．008 417X2X2－ 5X2X3－ 34．479 52X3X3，各因素的方差分析見表3。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Tab．3 Analyze of mean square

從表3可以看出，回歸模型是顯著的(P＜0．000 1)，該模型的決定系數(shù)為X2(培養(yǎng)時(shí)間)、X3培養(yǎng)溫度)、X1(接種量)、X1X3(接種量與培養(yǎng)溫度的交互作用)、X2X3(培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度的交互作用)，X1X2(接種量與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用)它們的Prob＞ F 值分別為0．000 366，0．000 541，0．002 219，0．022 327，0．022 388，0．032 774 對游離氨基酸總量的影響顯著，說明該模型的擬合度較好。從表3中還可以看出，影響游離氨基酸含量的各因素按影響大小排序依次為 X2(培養(yǎng)時(shí)間)、X3(培養(yǎng)溫度)、X1(接種量)。

由圖2 可得出，X1、X2、X3存在極值點(diǎn)，Y1的最大估計(jì)值為 280．56 mg/100 g，對應(yīng)的因素為接種量10．53%，培養(yǎng)溫度29．34 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為6．68 d。

圖2 接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度對氨基酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig．2 Surface layer of the effects of inoculation amount，culture time，culture temperature on amino acid content

2．2．4 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用優(yōu)化所得5個(gè)試驗(yàn)組合進(jìn)行靈芝對大豆固體發(fā)酵試驗(yàn)，所得游離氨基酸的含量分別:279．36 mg/100 g、278．96 mg/100 g、280．01 mg/100 g、278．98 mg/100 g、278．44 mg/100 g，平均含量為279．15 mg/100 g。初步探素到利用響應(yīng)面法對富硒靈芝對大豆固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化條件:大豆固體培養(yǎng)基接種靈芝富集液體種子液，接種量10．53%、發(fā)酵溫度29．34℃，發(fā)酵時(shí)間6．68 d后，發(fā)酵大豆中的游離氨基酸可達(dá)280．56 mg/100 g，與優(yōu)化前的游離氨基酸含量 169．55 mg/100 g［7］，相比提高了64．64%。

2．3 有機(jī)硒含量測定結(jié)果

由圖3結(jié)果表明，靈芝固態(tài)發(fā)酵物的有機(jī)硒含量為0．036%，而大豆粉中的有機(jī)硒含量為0．017%，優(yōu)化后有機(jī)硒的含量提高了1．1倍。

圖3 靈芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體與大豆的常規(guī)有機(jī)硒的含量的比較Fig．3 Comparison of solid fermentation of Ganoderma mycelium and soybean conventional organic selenium content

3 小結(jié)與討論

大豆固體培養(yǎng)基接種富硒靈芝種子液，分別在不同溫度、不同接種量和不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)的單因素試驗(yàn)中，分別獲得較佳培養(yǎng)溫度為30℃、接種量10%、大豆發(fā)酵培養(yǎng)6 d后，大豆發(fā)酵物中的游離氨基酸含量可達(dá)220 mg/100g以上。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)一步探索到利用響應(yīng)面法對富硒靈芝大豆固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)較優(yōu)組合條件:大豆固體培養(yǎng)基接種靈芝富集液體種子液，接種量10．53%、發(fā)酵溫度29．34℃，發(fā)酵時(shí)間6．68 d后，發(fā)酵大豆中的游離氨基酸可達(dá)280．56 mg/100 g，與優(yōu)化前的游離氨基酸含量169．55 mg/100 g相比提高了64．64%;發(fā)酵大豆中有機(jī)硒的含量可達(dá)0．036%，與優(yōu)化前相比提高了1．1倍。

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