李安平，田玉峰，謝碧霞，林親錄

(1．中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004;2．糧食深加工與品質(zhì)控制湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004)

燃料酒精一般通過微生物發(fā)酵制得，可以是原料經(jīng)過蒸煮糖化后發(fā)酵(傳統(tǒng)發(fā)酵法)，也可以是無蒸煮直接生料發(fā)酵(生料發(fā)酵法)［1］。原料蒸熟糊化需要消耗一定的能源和相應的設備投入，而生料發(fā)酵法卻可利用生淀粉直接發(fā)酵，而無需糊化和糖化等工序，相對而言操作工序更為簡便［2－3］。在酒精發(fā)酵產(chǎn)物中，除主要的酒精和二氧化碳外，同時也產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，包括醇(雜醇油、甲醇、丙醇)、醛(巴豆醛、乙醛)、酸(丁酸、醋酸)、酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯)等4類［4］。這些副產(chǎn)物主要與所用原料、酵母菌種和發(fā)酵途徑有關(guān)，其含量高低影響著酒精質(zhì)量。

橡實是泛指除大量栽培種板栗以外的殼斗科(Fagaceae)植物種仁的總稱［5］。我國橡實資源非常豐富，年產(chǎn)橡實估計在60～70億kg。橡實種仁中淀粉含量高達50% ～75%，然而大多數(shù)橡實種仁苦澀味重，不能直接食用，實際利用較少。以橡實淀粉為原料生產(chǎn)生物燃料酒精則是一條較好的利用途徑。栓皮櫟是橡實中較具代表性的品種，因此，本文以栓皮櫟為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精，比較生料發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵間在工藝參數(shù)、能耗和化學成分等方面的差異，以期為橡實燃料酒精發(fā)酵工藝生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

菌種:耐高溫型釀酒活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。原料:栓皮櫟(Quercus variabilis Blume)采自湖南省南岳衡山。酶制劑:糖化酶5 000 U/mL，上海瑞豐生物工程有限公司;α-淀粉酶5 000 U/mL，無錫賽德生物工程有限公司;酸性蛋白酶20 000 U/g無錫杰能科生物工程有限公司。

標樣:無水乙醇為AR級，葡萄糖、果糖、乳酸、琥珀酸、甘油和乙酸均為HPLC級。主要實驗儀器與設備采用LC－20A高壓液相色譜儀:日本島津公司;Agilent 7890A氣質(zhì)聯(lián)用儀:Agilent公司。

1．2 發(fā)酵方法

1．2．1 生料發(fā)酵工藝 橡實淀粉(50 g)→加水調(diào)配→同時加入α－淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、酵母菌株→發(fā)酵→蒸餾→酒精。

1．2．2 傳統(tǒng)發(fā)酵工藝 橡實淀粉(50 g)→加水調(diào)配→蒸煮→冷卻→液化→糖化→調(diào)pH→接種→發(fā)酵→蒸餾→酒精。

1．3 酒精濃度和酒精轉(zhuǎn)化率的測定［6］

取100 mL成熟的發(fā)酵醪液到蒸餾瓶中，加100 mL水，混勻后蒸餾。餾出液到100 mL時，用酒精比重計測定餾出液中的酒精濃度。

酒精轉(zhuǎn)化率=［酒精體積(mL)×酒精體積分數(shù)(%)］/淀粉含量(g)×100%

1．4 發(fā)酵醪液組分的測定［6-9］

色譜條件:流動相 0．01 mol/L H2SO4;流量 0．7 mL/min;柱溫60 ℃;進樣量20 μL。

樣品的預處理:將發(fā)酵醪液稀釋100倍后，準確量取2 mL稀釋后的發(fā)酵醪液，經(jīng)5 000 r/min離心10 min后取上清液，經(jīng)0．22 μm水系膜過濾后進樣。

1．5 發(fā)酵醪液揮發(fā)性組成的測定［8-9］

質(zhì)譜條件:(質(zhì)譜儀默認條件)電離方式:EI+;發(fā)射電流:200 μA;電子能量:70 eV;接口溫度:250℃;離子源溫度:200℃;檢測器電壓:350 V。

色譜條件:起始溫度35℃，保留時間3 min，升溫速率5℃/min，停止溫度50℃，升溫速率6℃/min，停止溫度130℃，升溫速率:10℃/min，停止溫度230℃，保留時間8 min。

進樣條件:進樣溫度250℃;載氣He;載氣流量0．8 mL/min。

樣品處理:固相微萃取，取10 mL樣品置于15 mL頂空瓶中，45℃水浴，用100 μm PDMS萃取頭吸附40 min后，自動進樣，解析3 min。

結(jié)果處理:化合物的定量使用Hewlett－Packard軟件按峰面積歸一化法計算各峰峰面積的相對百分含量，并根據(jù)上述條件下獲得的MS圖譜，結(jié)合色譜保留規(guī)律，與NIST譜庫作對比，確定化合物成分。

1．6 熱量計算方法［10］

(1)水吸收熱量Qc計算公式為:Qc=C·m·△t

其中:Qc為熱量，kJ;C為水的比熱容，4．2 kJ/(Kg·℃);m為質(zhì)量，kg;△t為變化的溫度，℃。

(2)水散熱量Qu計算公式為:Qu=U·A·△T·h

其中:Qu為熱量，kJ，不考慮熱輻射、對流等因素影響;U為空氣與水間之熱傳系數(shù)，50 W/(m2·K);A為接觸表面積，m2;△T為變化的溫度，℃;h為傳熱時間，h。

(3)各個工藝段所需熱量Q為醪液達到一定溫度所需熱量與恒溫時段所需補充的熱量之和。即:Q=Qc+Qu。

(4)蒸煮工段消耗熱量Q:Q=Qc+Qu=Cm△t+UA△Th

(5)液化工段消耗熱量Q:液化時，不需要將醪液從25℃加熱到60℃，只需從蒸煮后的100℃冷卻到 60 ℃，再恒溫 0．5 h，所以，Q=Qu=UA△Th。

(6)糖化工段消耗熱量Q:Q=Qu=UA△Th。

(7)主發(fā)酵工段消耗熱量Q:由于向醪液中添加酵母需要在室溫下進行，所以，要先讓醪液降溫至室溫，再加熱至所需溫度，并恒溫。Q=Qc+Qu=Cm△t+UA△Th。

1．7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用X±S表示，數(shù)據(jù)用SPSS 17 for Windows軟件中的獨立樣本t檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法對橡實淀粉酒精轉(zhuǎn)化率的影響

分別以等量的橡實(50 g)進行生料酒精發(fā)酵法和傳統(tǒng)酒精發(fā)酵法實驗，實驗條件和結(jié)果見表1。可看出，生料發(fā)酵糖化酶用量略大于傳統(tǒng)發(fā)酵，達到發(fā)酵終點的時間稍長于傳統(tǒng)發(fā)酵。生料發(fā)酵時間長是因為橡實淀粉沒有經(jīng)過高溫蒸煮，即淀粉沒有糊化，酵母在開始發(fā)酵時可資利用的葡萄糖較少，因此生料發(fā)酵需要消耗更多的糖化酶。生料發(fā)酵法的工序比傳統(tǒng)發(fā)酵法的工序簡單，減少了蒸煮、液化、糖化和調(diào)節(jié)初始pH等4個步驟，相應降低了對廠房、設備需求和人力的需求，從而降低了生產(chǎn)成本。生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法的料液比從1∶2．8遞增到1∶4，即使生料發(fā)酵法所需的水較少，對資源也是一種節(jié)約。實驗結(jié)果顯示，生料發(fā)酵的酒精度和酒精轉(zhuǎn)化率均略低于傳統(tǒng)發(fā)酵，但兩者無顯著性差異(P＞0．05)，結(jié)果基本接近，然而生料發(fā)酵法所需能耗卻低，工序更少。

表1 生料發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵的工藝參數(shù)和酒精轉(zhuǎn)化率的對比Tab．1 Comparison of the process parameters and alcohol conversion rate on the uncooked and cooked acorn starch fermentation technology

2．2 生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法的熱能消耗對比

在發(fā)酵溫度為36℃左右，橡實原料為50 g，反應容器為250 mL錐形瓶進行實驗。反應容器如果轉(zhuǎn)換成等體積的長方形容器(長×寬×高=0．05 m×0．05 m×0．1 m)，其表面積為0．022 5 m2。生料發(fā)酵法和傳統(tǒng)發(fā)酵法的拌料用水分別為1∶2．8和1∶4的情況下，拌料水消耗分別為0．14和0．20 kg，其熱能消耗結(jié)果見表2。

圖1 生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法所得發(fā)酵醪液組分HPLC圖Fig．1 Comparison of HPLC chromatograph of the fermented liquors on uncooked and cooked acorn starch fermentation technology

表2 生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法的能量消耗比較Tab．2 Comparison on the energy consumption on uncooked and cooked acorn starch fermentation technology

由表2可知，利用50 g橡實原料釀造成酒，2種發(fā)酵方法在主發(fā)酵工段熱能消耗沒有顯著差異(P＞0．05)，但在總的熱能消耗方面有顯著差異(P＜0．05)。傳統(tǒng)發(fā)酵法比生料發(fā)酵法多了3道工序，包括蒸煮工段、液化工段和糖化工段，熱能消耗增加了 184．986 kJ。在釀造過程中，生料發(fā)酵法比傳統(tǒng)發(fā)酵法節(jié)省熱能消耗共計182．215 kJ。通過換算，即加工1 t橡實原料，生料發(fā)酵可節(jié)省熱能3．8 ×106kJ，相當于節(jié)省164．8 kg標煤(煤的燃燒值為23 000 kJ/kg)。因此，生料發(fā)酵法能減少熱能消耗，降低生產(chǎn)成本。

2．3 生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法所得發(fā)酵醪液組分比較

發(fā)酵醪液組成成分的純度在一定程度上反映了酒精的質(zhì)量好壞，因此，通過HPLC對2種發(fā)酵方法產(chǎn)生的醪液組分進行了分析。由于待測定的葡萄糖、果糖、乙醇及甘油等均不含共軛雙鍵，無紫外光吸收，故選用示差折光檢測器檢測。對于其它的有機酸，因羧基中氧上孤對電子的躍遷，使其在205～215 nm有紫外吸收峰，所以選用紫外檢測器檢測，并將波長設定為均有較大吸收的205 nm。結(jié)果見圖1和表3。圖中A1、A2、A3分別為用示差折光檢測器檢測的標準樣品、生料發(fā)酵醪液和傳統(tǒng)發(fā)酵的發(fā)酵醪液的色譜圖，B1、B2、B3分別為用紫外可見檢測器檢測的標準品、生料發(fā)酵醪液和傳統(tǒng)發(fā)酵醪液的色譜圖。

由進樣量為100 mg/L的標樣色譜圖可知，圖1中的峰1代表果糖、峰2代表葡萄糖、峰3代表甘油、峰4代表乙醇、峰5代表乙酸、峰6代表乳酸、峰7代表琥珀酸。由圖1中的A2和A3比對，B2和B3比對可以看出，稀釋100倍后的傳統(tǒng)發(fā)酵醪液中的葡萄糖、甘油、乙酸、乳酸、琥珀酸含量均高于生料發(fā)酵醪液，而果糖、乙醇含量則差別不大。HPLC的分析表明生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法的主要產(chǎn)物均是乙醇，主要副產(chǎn)物是乙酸、甘油、乳酸和琥珀酸。生料發(fā)酵法醪液的雜質(zhì)如酸類、甘油、糖類均低于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝。

表3 生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法所得發(fā)酵醪液組分含量Tab．3 Comparison of ingredients of the fermented liquors on uncooked and cooked acorn starch fermentation technology

圖2 生料發(fā)酵GC-MS圖譜Fig．2 GC-MS chromatograph of the uncooked acorn starch fermented liquors

圖3 傳統(tǒng)發(fā)酵GC-MS圖譜Fig．3 GC-MS chromatograph of the cooked acorn starch fermented liquors

2．4 生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法中發(fā)酵醪液揮發(fā)性組分的比較

生料發(fā)酵法與傳統(tǒng)發(fā)酵法兩種不同工藝對酒精質(zhì)量的影響在一定程度上可通過發(fā)酵醪液的揮發(fā)性成分反映出來。GC－MS的分析結(jié)果見圖2和圖3，表3、表4和表5。

表4 生料發(fā)酵GC-MS成分Tab．4 Ingredients of the liquors of uncooked acorn starch fermented by GC-MS

表5 傳統(tǒng)發(fā)酵GC-MS成分Tab．5 Ingredients of the liquors of cooked acorn starch fermented by GC-MS

從表4、表5的GC－MS分析結(jié)果可以看出，橡實淀粉的生料發(fā)酵液法與傳統(tǒng)發(fā)酵法的醪液均檢出了12種化合物，包括乙醇、乙酸乙酯、2－羥基丙腈、丁酸、正戊醇、乙基正己酸酯、乙酸、仲丁基甲醇、苯乙醇、2－壬酮、乙醛、2，3－丁二醇，其主要揮發(fā)性組分均有乙醇、2，3－丁二醇、仲丁基甲醇等，但生料發(fā)酵液法比傳統(tǒng)發(fā)酵法的醪液少檢出3－乙氧基丙醇、3－甲基－3－丁烯醇和乳酸外。

由表6可看出，橡實淀粉生料發(fā)酵法和傳統(tǒng)發(fā)酵法的醪液相比，各揮發(fā)性物質(zhì)在各自發(fā)酵醪液中所占比例基本接近。

表6 生料發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵成熟醪GC-MS綜合比較Tab．6 Systematic comparison of raw material and classical technology by GC-MS

3 小結(jié)

橡實不僅資源豐富，而且淀粉含量高，以橡實淀粉為原料生產(chǎn)燃料酒精具有廣闊的前景，可作為我國綠色能源供應多元化戰(zhàn)略的有益補充。生料發(fā)酵法和傳統(tǒng)發(fā)酵法相比，工藝更為簡便，設備投入更少，能耗更低，具有比較優(yōu)勢。GC-MS及HPLC分析顯示，與傳統(tǒng)發(fā)酵法相比，生料發(fā)酵法雖然所產(chǎn)生的酒精含量接近，但酒精質(zhì)量更優(yōu)。

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