潘曉青，魏 瑾，張 明，林 琳，單 虎，閆 蕊，賀 樂

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710004)

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)系統(tǒng)由 Trx、Trx還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)組成。Trx主要分為Trx1和Trx2。目前對(duì)該系統(tǒng)中TrxR和Trx1的研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛，對(duì)Trx2功能的研究相對(duì)較少。已有研究顯示，它除了具有Trx家族基本的抗氧化應(yīng)激作用外，還有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)基因表達(dá)及促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用[1－3]。Trx2是存在于線粒體中的分子量12 kD的小分子蛋白，2000年P(guān)owis等[4]通過 Western blotting證實(shí)了 Trx2的線粒體定位。因其特異存在于線粒體又被稱為線粒體型硫氧還蛋白。Trx2是線粒體內(nèi)膜蛋白中清除活性氧簇的主要蛋白，在維持細(xì)胞存活、降低氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用[5]。有研究顯示低硒及冰泳刺激等因素可影響Trx系統(tǒng)的表達(dá)[6]。但是低硒對(duì)特異存在于線粒體的Trx2蛋白表達(dá)的影響及Trx2對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)該問題作進(jìn)一步研究。

材料和方法

1 主要試劑

心肌線粒體提取試劑盒購自北京寶賽;Trx2兔抗鼠多克隆抗體購自Proteintech;Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas－associated death domain protein，F(xiàn)ADD)兔抗鼠多克隆抗體購自Bioss;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)和超敏發(fā)光液購自Pierce Biotechnology，SP染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

2 動(dòng)物

將36只2周齡SD大鼠隨機(jī)分成低硒(low selenium，LS)組及對(duì)照(normal control，NC)組，每組18只(雌雄比例相同)，低硒組以人工合成低硒酵母飼料喂養(yǎng)(硒含量0.01 mg/kg)，對(duì)照組以本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的常規(guī)飼料喂養(yǎng)(硒含量0.1～0.3 mg/kg)。

3 主要方法

3.1 在體心功能檢測 分別于第20周、30周及40周時(shí)進(jìn)行，每個(gè)時(shí)點(diǎn)各選6只大鼠(雌雄比例相同，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h)，20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔麻醉后，把大鼠仰臥固定于動(dòng)物臺(tái)上，連接導(dǎo)管與壓力傳感器，計(jì)算機(jī)上校準(zhǔn)基線。分離一側(cè)頸動(dòng)脈，在頸動(dòng)脈上剪一斜口，將動(dòng)脈插管經(jīng)該斜口送達(dá)左心室。固定動(dòng)脈導(dǎo)管，穩(wěn)定10 min，記錄的主要指標(biāo)有:左心室峰值收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximum rate of left ventricular pressure rise/decay，±dp/dtmax)。取10組連續(xù)穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，以Chart 5 for Windows軟件進(jìn)行分析。

心功能測量完畢后，麻醉狀態(tài)下快速取心臟。用刀片切取1塊大小約(3～5)mm×(3～5)mm×(10～15)mm的心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h后包埋成石蠟標(biāo)本，用于免疫組化染色。另取約200 mg心肌組織，按線粒體提取試劑盒的說明提取心肌線粒體。

3.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting) 用RIPA裂解液提取線粒體蛋白，超微量紫外分光光度儀對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量后行Western blotting檢測，每梳孔上樣量30 μg，凝膠電泳分離后半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)到PVDF膜上。Trx2的轉(zhuǎn)膜條件為恒流1 mA/cm2膜面積，轉(zhuǎn)膜時(shí)間20 min。電壓依賴性陰離子通道1(voltage－dependent anion channel 1，VDAC1)轉(zhuǎn)膜條件為恒流 2 mA/cm2膜面積，轉(zhuǎn)膜時(shí)間 45 min。50 g/L脫脂奶粉封閉后加Ⅰ抗，Ⅰ抗孵育濃度為Trx2(1∶500)，VDAC1(1∶800)，孵育條件為 4 ℃ 過夜。以VDAC1作為內(nèi)參照[7]。洗膜后加Ⅱ抗室溫孵育2 h，PBST洗膜5 min×6次，用ECL顯色并分析。

3.3 免疫組織化學(xué)法檢測FADD的表達(dá) 采用免疫組化SP法，石蠟標(biāo)本切片后常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后滴加3%H2O2消除過氧化物酶。正常山羊血清封閉37℃15 min后，將FADDⅠ抗以1∶50稀釋，4℃孵育過夜;復(fù)溫20分鐘，PBS浸洗。Ⅱ抗37℃孵育20 min，PBS浸洗;Ⅲ抗37℃孵育20 min，PBS洗5 min，3次。DAB顯色，蘇木素襯染，封片。設(shè)置對(duì)照組，用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照，其它步驟相同。光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖片分析。結(jié)果判定:以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。每張切片觀察3個(gè)高倍(×400)視野，每個(gè)視野連續(xù)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，其中陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞百分比即為陽性細(xì)胞指數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 低硒大鼠心肌線粒體Trx2蛋白表達(dá)結(jié)果

NC組大鼠在20周、30周及40周時(shí)，其心肌線粒體Trx2蛋白的表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05);LS組20周時(shí)其心肌線粒體Trx2蛋白的表達(dá)水平已明顯低于相應(yīng)時(shí)段NC組大鼠，隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長，該組大鼠心肌線粒體Trx2蛋白表達(dá)的降低程度更為明顯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，30周時(shí)明顯低于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)NC組，亦明顯低于20周的LS組，40周時(shí)明顯低于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)NC組，亦明顯低于20周及30周的LS組(均P＜0.05)，見圖 1。

2 在體心功能檢測結(jié)果

如表1所示，低硒喂養(yǎng)20周時(shí)，LVSP及+dp/dtmax已出現(xiàn)明顯降低，而 LVEDP及－dp/dtmax與NC組比較無明顯差異。30周、40周時(shí)，LS組收縮功能與舒張功能均較NC組減低;LS組隨低硒喂養(yǎng)時(shí)間延長，LVSP及+dp/dtmax減低更為明顯，30周 與20周、40周與30周及40周與20周 組間兩兩比較，差異均顯著 (P＜0.05)。

Figure1.The expression level of Trx2 protein at different time points.NC:normal control;LS:low selenium;VDAC1:voltage－dependent anion channel 1，as an internal control..n=6.*P＜0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.圖1 不同時(shí)點(diǎn)Trx2蛋白的表達(dá)水平

表1 不同喂養(yǎng)時(shí)間大鼠在體心功能測定結(jié)果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

表1 不同喂養(yǎng)時(shí)間大鼠在體心功能測定結(jié)果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

NC:normal control;LS:low selenium.*P ＜0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.

Time(week) Group LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) －dp/dtmax(mmHg/s)20 NC 130.30 ±3.72 －1.38 ±0.33 10430.00 ±808.567645.60 ±962.46 LS 113.30 ±2.21* －2.72 ±2.07 7366.10 ±455.61* 6851.03 ±654.3430 NC 118.97 ±5.31 1.43 ±2.51 8582.62 ±621.14 6255.50 ±728.67 LS 103.82 ±5.24＊△ －2.82 ±1.63* 6160.68 ±402.17＊△ 4982.80 ±613.21*40 NC 120.08 ±3.29 －0.92 ±1.59 8295.88 ±1318.29 6523.60 ±708.93 LS 97.74 ±2.87＊△# －2.88 ±1.18* 5381.21 ±646.72＊△# 3863.32 ±348.00*

3 心肌細(xì)胞凋亡情況的免疫組化結(jié)果

采用SP法染色，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒視為凋亡陽性細(xì)胞。由圖2可見，NC組棕色細(xì)胞較少，而LS組棕色細(xì)胞較多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NC組間對(duì)比未見明顯差異(P＞0.05)，LS組與相應(yīng)時(shí)段NC組相比，差異均顯著;LS各組間(30周與20周、40周與30周、40周與20周)相比，均有顯著差異(P＜0.05)。

4 Trx2與心功能及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)之間的相關(guān)性分析

K－S法正態(tài)性檢驗(yàn)顯示，Trx2、LVSP和+dp/dtmax的P值均大于0.05，可視為近似正態(tài)分布資料，而心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布。相關(guān)性分析結(jié)果為，Trx2與 LVSP的相關(guān)系數(shù)為0.872(P＜0.01)，見圖 3;Trx2與 +dp/dtmax的相關(guān)系數(shù)為0.822(P＜0.01)，見圖4。Trx2與凋亡細(xì)胞指數(shù)的相關(guān)系數(shù)為 －0.858(P ＜0.01)，見圖5。

討 論

Figure2.The immunohistochemical results of apoptosis of myocardial cells in rats at different time points(SP，×400).NC:normal control;LS:low selenium..n=6.*P ＜ 0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.圖2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡免疫組化染色結(jié)果

Figure3.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and LVSP of rats.圖3 大鼠心肌線粒體Trx2表達(dá)量與LVSP的相關(guān)性

Figure4.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and+dp/dtmaxof rats.圖4 大鼠心肌線粒體Trx2表達(dá)量與+dp/dtmax的相關(guān)性

Figure5.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and apoptotic index of myocardial cells in rats.圖5 大鼠心肌線粒體Trx2表達(dá)量與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的相關(guān)性

Trx2的基本功能為抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用，為了解Trx2在心肌細(xì)胞線粒體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響，本實(shí)驗(yàn)在前期低硒大鼠蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，完成了低硒大鼠心肌線粒體中Trx2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其在心肌細(xì)胞損傷中的作用研究，并對(duì)Trx2抗凋亡機(jī)制進(jìn)行初步探討。

張?jiān)谙愕萚8]在觀察低硒大鼠不同組織硒蛋白利用硒的優(yōu)先性研究中，發(fā)現(xiàn)20周后才能明確觀察到低硒對(duì)硒敏感蛋白的影響，其低硒大鼠造模時(shí)間為20周，為此，本研究參照該研究，從低硒喂養(yǎng)20周開始觀察。在我們的研究中，大鼠低硒喂養(yǎng)20周時(shí)，與NC組相比，其Trx2蛋白表達(dá)已出現(xiàn)明顯降低。隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長，Trx2表達(dá)降低更明顯。這與滕宗艷等[6]的研究結(jié)果相一致，他們低硒喂養(yǎng)大鼠14周，冰泳刺激5 min后用Western blotting法測大鼠心肌TrxR及Trx表達(dá)，發(fā)現(xiàn)常硒冰泳組TrxR及Trx蛋白表達(dá)增高。與常硒組相比，低硒冰泳組TrxR及Trx蛋白表達(dá)降低而血中脂質(zhì)過氧化物含量增高。因此他們認(rèn)為低硒條件下心肌Trx系統(tǒng)功能降低，遇到冰泳負(fù)荷時(shí)心肌不能及時(shí)清除過剩的自由基及修復(fù)損傷的蛋白，使心肌易受損傷。蔡成等[9]研究了Trx2對(duì)高氧肺損傷線粒體的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)人肺腺癌A549細(xì)胞在高氧環(huán)境暴露48 h后，細(xì)胞線粒體中Trx2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均減弱，A549細(xì)胞出現(xiàn)凋亡甚至損傷致死。這種變化表明Trx2表達(dá)減弱時(shí)對(duì)高氧肺損傷的線粒體的保護(hù)作用亦減弱。張超英等[10]對(duì)低硒與大鼠心肌組織脂質(zhì)過氧化及心肌細(xì)胞損傷關(guān)系的研究顯示，在12周時(shí)低硒組大鼠心肌組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛較加硒組顯著為高，低硒組心肌凋亡細(xì)胞檢出率為87.5%也明顯高于加硒組(檢出率25.0%)。在本實(shí)驗(yàn)中，低硒組大鼠心臟收縮及舒張功能均降低，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，而Trx2的表達(dá)量與LVSP和+dp/dtmax呈正相關(guān)，與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。

根據(jù)已有研究，分析本實(shí)驗(yàn)Trx2表達(dá)下降的原因可能為:(1)線粒體通過氧化磷酸化過程為細(xì)胞提供ATP的同時(shí)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，是生理狀態(tài)下ROS產(chǎn)生的主要來源。低硒時(shí)含硒酶及有關(guān)蛋白合成減少，ROS清除不足，線粒體功能受損，ATP供應(yīng)不足，導(dǎo)致Trx2蛋白合成減少;(2)氧化應(yīng)激等因素可使氧化型Trx2增加，氧化型的Trx2更易被降解。Zhang等[11]研究認(rèn)為氧化型的Trx2的降解可能由線粒體基質(zhì)內(nèi)Lon蛋白酶執(zhí)行的，Lon蛋白酶是2002年才被發(fā)現(xiàn)的位于線粒體基質(zhì)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)量控制的酶，它的作用是把體內(nèi)損壞的蛋白質(zhì)分解并清除掉。Trx2的降解使線粒體抗氧化系統(tǒng)的主要蛋白Trx2減少，其結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷進(jìn)一步加重，如此形成惡性循環(huán)。對(duì)于Trx2抗凋亡機(jī)制，Tanaka等[11]的實(shí)驗(yàn)顯示Trx2與細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)發(fā)生了免疫共沉淀反應(yīng)，認(rèn)為Trx2通過與線粒體基質(zhì)中的促凋亡蛋白CytC錨定，二者形成復(fù)合物，通過抑制凋亡信號(hào)的傳遞而抑制細(xì)胞凋亡。而Trx2是否與CytC結(jié)合發(fā)揮抗凋亡作用尚有爭議，還需進(jìn)一步研究。

目前針對(duì)Trx2的研究大多數(shù)是從組織或細(xì)胞水平提取該蛋白來進(jìn)行的，由于Trx2僅特異性表達(dá)于線粒體，為避免細(xì)胞內(nèi)其它非特異性蛋白的干擾，提高樣品蛋白中Trx2的豐度，使所得結(jié)果更加可靠，本研究首次采用了先純化心肌線粒體，在此基礎(chǔ)上提取線粒體蛋白來進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，實(shí)踐證明該方法是可行且可靠的。

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