包翠芬， 劉玉玲， 邵佑之

(遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 錦州 121001)

引起急性腎損傷 (acute kidney injury，AKI)的原因可以是缺血，如休克、腎移植、腎血管手術(shù)等，因此又叫缺血性 AKI(ischemic AKI，IAKI)[1];也可以是非缺血原因，如雙側(cè)腎切除(bilateral nephrectomy，BNx)后而導(dǎo)致的AKI叫非缺血性AKI(non－ischemic AKI)。臨床上AKI病人的死亡率很高。其中部分AKI病人的致死原因常常是腎外器官衰竭引起的，如AKI誘導(dǎo)的急性肝臟損傷(acute liver injury，ALI)[2]。然而 AKI誘導(dǎo) ALI的機(jī)制至今尚不清楚[2－4]。原因之一是尚不十分清楚AKI引起的肝臟細(xì)胞受損在細(xì)胞學(xué)上有何特點(diǎn)。晚近一些報(bào)道提出AKI可引起非腎臟器官的細(xì)胞凋亡，并認(rèn)為AKI引起細(xì)胞凋亡的器官是有選擇性的[5]。經(jīng)腫瘤壞死因子受體 α (tumor necrosis factor receptor α，TNFRα)啟動(dòng)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族激活途徑的細(xì)胞死亡叫外源性凋亡(extrinsic apoptosis)[6－7]。應(yīng)用caspase抑制劑可以阻止這種途徑凋亡的發(fā)生。這種途徑的細(xì)胞凋亡是否參與AKI所引起的肝細(xì)胞損傷國(guó)內(nèi)外尚無(wú)詳細(xì)的報(bào)道。本文應(yīng)用光、電鏡技術(shù)以及免疫印跡、免疫組織化學(xué)染色方法探討AKI導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)。

材料和方法

1 動(dòng)物

健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 主要儀器及試劑

兔抗大鼠 TNFRα抗體、caspase－3抗體購(gòu)自Abcam，PV6001 II抗試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司;石蠟切片機(jī)、超薄切片機(jī)(Leica);透射電鏡(日本電子公司)。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物的選擇及AKI模型的建立 健康SD大鼠按實(shí)驗(yàn)條件分3組:IAKI組10只，苯巴比妥鈉麻醉后開(kāi)腹，應(yīng)用無(wú)損傷血管夾阻斷雙側(cè)腎動(dòng)脈血流60min后放開(kāi)血管夾;假手術(shù)(sham)組10只，手術(shù)過(guò)程同前，只是不阻斷腎動(dòng)脈血流BNx組10只，行雙腎切除。3組動(dòng)物關(guān)腹后于無(wú)菌條件下飼養(yǎng)24 h后取材。先經(jīng)腹主動(dòng)脈取血2 mL用于腎功能和肝功能的常規(guī)檢查。取部分左腎，肝左葉組織用于免疫印跡分析。然后采用2.5%多聚甲醛戊二醛灌流右腎、肝右葉組織進(jìn)行光鏡、電鏡標(biāo)本制備。

3.2 腎功能和肝功能的測(cè)定 應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀，比色法測(cè)定血清肌酐(serum creatinine，SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，賴氏法測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)。

3.3 TNFRα和caspase－3免疫印跡測(cè)定 新鮮腎(只測(cè)caspase－3)和肝組織加入RIPA裂解液，0℃下剪碎和超聲波粉碎20 s后靜置30 min，4℃、12000 r/min離心20 min，留取上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量，并按每20 μL含50 μg蛋白制成樣品，－20℃冰箱保存。取已制備樣品適量加入電泳槽，100 V電壓下電泳，轉(zhuǎn)膜，常溫下半干轉(zhuǎn)印，TBST沖洗后，5% 小牛血清白蛋白室溫封閉1～2 h。分別加入I抗(TNFRα抗體，caspase－3抗體，稀釋度為1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min;分別加入II抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG抗體，稀釋度為1∶200)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min;ECL發(fā)光顯色;采用β－actin作為內(nèi)參照。掃描電泳條帶，用凝膠分析軟件分析各蛋白目的條帶吸光度。根據(jù)目的條帶與內(nèi)參照條帶吸光度的比值表示待測(cè)蛋白含量。

3.4 光、電鏡標(biāo)本的制備 經(jīng)2.5%多聚甲醛戊二醛灌流固定的右腎，肝右葉組織再加入2.5%多聚甲醛戊二醛續(xù)固定24 h。部分梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，Leica RM2135石蠟切片機(jī)切片，厚度5～7 μm切片，HE染色。部分組織經(jīng)1% 鋨酸固定，梯度乙醇、丙酮脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑包埋，LKB－V超薄切片機(jī)1 μm半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色后光鏡觀察，定位后再進(jìn)行超薄切片，重金屬雙染，1200EX透射電子顯微鏡下觀察。

3.5 Caspase－3的免疫組織化學(xué)染色 采用石蠟切片免疫組化Envision法染色。切片常規(guī)脫蠟至水，3% 過(guò)氧化氫溶液處理30 min以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓修復(fù)抗原，分別滴加適當(dāng)稀釋的Ⅰ抗(單克隆抗體caspase－3)，4℃過(guò)夜，滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體(PV6001)37℃孵育 30 min，DAB顯色。以上各步驟之間用0.01 mol/L PBS洗滌3次，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照用PBS替代Ⅰ抗。蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腎功能和肝功能檢查結(jié)果

BNx組動(dòng)物血 BUN 為(36.1 ±2.1)mmol/L，SCr為(321±26)mmol/L。IAKI組動(dòng)物血BUN為(39.1±2.7)mmol/L，SCr為(318 ±26)mmol/L。Sham 組動(dòng)物血 BUN 為(4.2 ±0.8)mmol/L，SCr為(88 ±17)mmol/L。IAKI組 ALT為(378±33)U/L，BNx組為(367±43)U/L，sham 組為(97±22)U/L。與 sham組相比較，IAKI組和BNx組的腎、肝功能指標(biāo)均有明顯差異(P ＜0.05)。

2 免疫印跡的結(jié)果

與sham組動(dòng)物肝臟相比，無(wú)論是IAKI組還是BNx組動(dòng)物肝臟的TNFRα和caspase－3的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，見(jiàn)圖1A。與sham組腎臟相比，IAKI組腎臟caspase－3的表達(dá)增強(qiáng)，見(jiàn)圖1B。

3 光鏡下HE染色切片和caspase－3免疫組化染色觀察結(jié)果

3.1 腎臟 Sham組動(dòng)物腎臟顯示出正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2A。IAKI動(dòng)物腎臟腎小管大面積壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，崩潰脫落，有時(shí)整個(gè)小管截面細(xì)胞消失。特別在近髓質(zhì)以及髓質(zhì)外帶中近端小管細(xì)胞大片壞死，壞死細(xì)胞淺淡，細(xì)胞內(nèi)大量空泡出現(xiàn)。在壞死的細(xì)胞之間可見(jiàn)大量散在的凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞固縮，著色深，核染色質(zhì)固縮表現(xiàn)，見(jiàn)圖2B。Caspase－3 IHC染色sham組腎臟呈陰性反應(yīng)，見(jiàn)圖2C。IAKI組髓質(zhì)外帶近端小管上皮內(nèi)可見(jiàn)較多的caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性反應(yīng)顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見(jiàn)圖2D。

Figure1.The results of Western blotting.A:both IAKI and BNx rat livers had stronger expression of TNFRα and caspase－3;B:IAKI rat kidneys had stronger expression of caspase－3..n=10.＊＊P＜0.01 vs sham.圖1 免疫印跡結(jié)果

Figure2.Light microscopic photographs of rat kidneys with HE staining(A，B)and caspase－3 immunohistochemical staining(C，D)(×400).A，C:sham group;B，D:IAKI group.Arrows in B indicate apoptotic cells，while those in D indicate caspase－3－positive cells.圖2 各組大鼠腎臟HE染色和caspase－3免疫組化染色的光鏡照片

3.2 肝臟 Sham組動(dòng)物肝臟呈正常組織表現(xiàn)，見(jiàn)圖3A。AKI誘導(dǎo)的肝臟發(fā)生了明顯的灶狀壞死，這種壞死灶可大可小，著色蒼白。在壞死灶內(nèi)雖然可見(jiàn)排列紊亂的肝板但已無(wú)可辨認(rèn)的肝細(xì)胞存在，被嗜酸性絮狀物所代替。絮狀物內(nèi)無(wú)完整的肝細(xì)胞核，只殘留少許核碎片及粒細(xì)胞浸潤(rùn)。此外還可見(jiàn)到固縮的肝細(xì)胞散在肝板內(nèi)，細(xì)胞染色深，與周邊肝細(xì)胞明顯不同。有的細(xì)胞核固縮，有的核萎縮。細(xì)胞形狀分2種，一種細(xì)胞呈星狀，見(jiàn)圖3B，另一種呈球狀，見(jiàn)圖3C，前者細(xì)胞核萎縮，后者細(xì)胞核染色質(zhì)固縮。

Sham組肝臟caspase－3 IHC染色呈陰性反應(yīng)，見(jiàn)圖3D。AKI組肝臟可見(jiàn)較多的caspase－3 IHC染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性反應(yīng)顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見(jiàn)圖3E、F，特別是在壞死灶周邊以及肝小葉界板內(nèi)多見(jiàn)。

4 電子顯微鏡觀察所見(jiàn)

Sham組肝細(xì)胞顯示出正常結(jié)構(gòu):細(xì)胞核染色質(zhì)疏松，核仁明顯，各種細(xì)胞器均發(fā)達(dá)，內(nèi)含物豐富，見(jiàn)圖4A。AKI動(dòng)物肝臟內(nèi)呈星狀的固縮肝細(xì)胞表現(xiàn)出副凋亡特點(diǎn):細(xì)胞基質(zhì)電子密度高，細(xì)胞核萎縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈小空泡串珠樣擴(kuò)張，線粒體變性均質(zhì)狀或空泡化，見(jiàn)圖4B。呈近球形的固縮肝細(xì)胞表現(xiàn)出了凋亡細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn):細(xì)胞皺縮，基質(zhì)電子密度也高，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，見(jiàn)圖4C。

Figure3.Light microscopic photographs of rat livers with HE staining(A，B，C)and caspase－3 immunohistochemical staining(D，E，F(xiàn))(×400).A，D:sham group;B，E:BNx group;C，F(xiàn):IAKI group.Arrows in B and C indicate pyknotic hepatocytes，while those in E and F indicate caspase－3 －positive hepatocytes.圖3 各組大鼠肝臟HE染色和caspase－3免疫組化染色的光鏡照片

Figure4.Electron microscopic photographs of rat hepatocytes(×8000).A:a photograph of a normal hepatocyte in sham group;B:a photograph of hepatocyte undergoing para－apoptosis in BNx group showed mitochondrial vacuolization and nuclear shrinkage;C:a photograph of a hepatocyte undergoing apoptosis in IAKI group showed cytoplasmic shrinkage and a nucleus with pyknotic and marginated chromatin.圖4 各組大鼠肝細(xì)胞電鏡圖像

討 論

大鼠腎缺血45～60 min再灌注24 h引起的AKI是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的IAKI動(dòng)物模型，而B(niǎo)Nx又是公認(rèn)的非缺血性AKI的動(dòng)物模型[3－4]。從研究的結(jié)果可以看出大鼠腎缺血60 min再灌注24 h后腎功能嚴(yán)重?fù)p傷，與雙腎切除24 h的動(dòng)物血清BUN和SCr的水平相近，說(shuō)明2組動(dòng)物的腎功能都發(fā)生了損傷，也說(shuō)明本文的缺血性和非缺血性AKI動(dòng)物模型都是成功的。同時(shí)本文也發(fā)現(xiàn)IAKI動(dòng)物和BNx動(dòng)物都發(fā)生了血清ALT明顯增高，說(shuō)明2組動(dòng)物的肝臟功能受到了較嚴(yán)重的損害。

本文形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)IAKI腎小管是腎缺血再灌注損傷的重災(zāi)區(qū)。特別是近髓質(zhì)和髓質(zhì)外帶區(qū)域中的近端小管損傷尤為嚴(yán)重，表現(xiàn)為大面積上皮細(xì)胞壞死以及壞死細(xì)胞之間明顯的細(xì)胞凋亡，構(gòu)成了IAKI動(dòng)物急性腎功能損傷的病理學(xué)基礎(chǔ)。免疫印跡和免疫組化染色結(jié)果說(shuō)明IAKI腎臟出現(xiàn)了明顯的caspase依賴的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明除了腎小管細(xì)胞壞死外細(xì)胞凋亡也構(gòu)成了腎臟缺血60 min再灌注24 h后的一個(gè)不可忽視的細(xì)胞損傷方式。

從免疫印跡法檢測(cè)的結(jié)果可以看出 TNFRα蛋白在AKI(包括IAKI和BNx)動(dòng)物肝臟內(nèi)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明AKI誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡是由于某些外源性因素通過(guò)TNFRα啟動(dòng)而引起的。同時(shí)AKI動(dòng)物肝臟的caspase－3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。免疫組化染色結(jié)果也證實(shí)caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞在AKI動(dòng)物肝臟內(nèi)的存在?，F(xiàn)已公認(rèn)caspase家族的激活可使受損細(xì)胞向細(xì)胞凋亡方向發(fā)展，具體的凋亡執(zhí)行者(executor)是激活了的caspase－3，是外源性細(xì)胞凋亡的主要途徑。因此被稱作為caspase依賴性細(xì)胞死亡(caspase-dependent cell death)[6－7]。Hassoun等[8]發(fā)現(xiàn)腎缺血性再灌注損傷時(shí)肺臟內(nèi)出現(xiàn)了經(jīng)TNFRα啟動(dòng)的caspase依賴性細(xì)胞死亡。本文的結(jié)果說(shuō)明經(jīng)TNFRα啟動(dòng)的caspase依賴的細(xì)胞死亡也參與了AKI誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。這為AKI腎外器官特別是肝臟受損機(jī)理的研究提供了新的視野。

IAKI組動(dòng)物和BNx組動(dòng)物相比較會(huì)發(fā)現(xiàn)兩者腎功能衰竭的程度相近，免疫印跡法和免疫組化染色結(jié)果也相似，不同是前者體內(nèi)有一對(duì)缺血60 min再灌注24 h內(nèi)含細(xì)胞凋亡的腎臟而后者沒(méi)有。然而B(niǎo)Nx動(dòng)物肝臟內(nèi)卻出現(xiàn)了與IAKI動(dòng)物同樣的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明AKI誘導(dǎo)肝臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡是由于AKI所致尿毒物質(zhì)引起的。而與IAKI引起的細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。換句話說(shuō)，在IAKI肝臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡并不是腎缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的。

形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡共同構(gòu)成了AKI誘導(dǎo)肝功能損傷的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。本文用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)了固縮肝細(xì)胞的出現(xiàn)。固縮肝細(xì)胞可分2種;一種呈球形，細(xì)胞核固縮，用電子顯微鏡觀察證明屬于細(xì)胞凋亡(圖4C)。而另外一種呈星形，它與Park及助手們?cè)?011年光鏡下發(fā)現(xiàn)的相一致，遺憾的是他們當(dāng)時(shí)沒(méi)有進(jìn)行電鏡觀察，只把它歸于一種死亡的肝細(xì)胞，命名為固縮性細(xì)胞死亡(pyknotic cell death)[9]。我們也發(fā)現(xiàn)了這種細(xì)胞出現(xiàn)在AKI肝臟內(nèi)，并用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)它既不具有壞死細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，也不具有細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。其細(xì)胞核萎縮但染色質(zhì)無(wú)固縮邊聚的表現(xiàn)，細(xì)胞基質(zhì)電子密度極高，細(xì)胞內(nèi)被細(xì)小空泡化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡化的線粒體所充滿。這與副凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)很相似。有學(xué)者認(rèn)為副凋亡又稱為非溶酶體空泡性細(xì)胞死亡(non－lysosomal vesiculate cell death)，其細(xì)胞核不具有凋亡細(xì)胞核的表現(xiàn)，特點(diǎn)是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體空泡化而造成的細(xì)胞質(zhì)死亡(cytoplasmic death)[10]。這些描述與本文電鏡下所見(jiàn)相同(圖4B)，因此我們認(rèn)為Park所說(shuō)的固縮性死亡是一種副凋亡的肝細(xì)胞。至于AKI引起肝細(xì)胞副凋亡的機(jī)制如何尚需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，我們認(rèn)為:(1)AKI所致肝細(xì)胞凋亡可能是經(jīng)TNFRα啟動(dòng)的caspase依賴的細(xì)胞死亡;(2)副凋亡也參與了AKI所致肝細(xì)胞損傷。

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