曾 葭，陳小宇，祝愛珍，劉成成，譚廣銷，劉革修△

(1解放軍第411醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200081;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合化療方案和表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor，EGFR-TKI)是當(dāng)前針對(duì)EGFR基因非突變或突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者首選治療措施[1-3]，但由于存在繼發(fā)耐藥與復(fù)發(fā)問題，延長(zhǎng)患者生存期的作用有限[4-6]。如何克服耐藥已成為目前研究熱點(diǎn)之一[7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)一種名為鹽霉素(salinomycin)的抗生素可以殺死腫瘤干細(xì)胞，克服耐藥，其效力比普通抗癌藥物泰克索(taxol)高100倍[10-13]。我們前期研究顯示，鹽霉素能誘導(dǎo)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討鹽霉素聯(lián)合吉非替尼誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株A549凋亡的協(xié)同作用，為鹽霉素應(yīng)用于肺腺癌治療探索新的思路。

材料和方法

1 材料

人肺腺癌細(xì)胞株A549由本實(shí)驗(yàn)室保存。鹽酸吉非替尼購(gòu)自湖北老百姓藥業(yè)有限公司，鹽霉素和PI染料購(gòu)自Sigma;RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自 Gibco;細(xì)胞內(nèi)活性氧、caspase-3、caspase-8、caspase-9活性以及JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞色素C凋亡檢測(cè)試劑盒為BioVision;Fluo-3AM購(gòu)自Biotium;Epics XL型流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 以每瓶1×105細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，采用含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液置于含5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%融合度時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔180 μL(5×103細(xì)胞)接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別加入鹽霉素(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 和 3.20 μmol/L)、吉非替尼(0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0 和 16.0 μmol/L)以及吉非替尼(0.50 μmol/L)聯(lián)合不同濃度的鹽霉素(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 和 3.20 μmol/L)，進(jìn)行藥物干預(yù)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、僅含有DMSO的溶媒對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，37℃培養(yǎng)4 h后低速離心10 min吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A值-空白組平均A值)/(對(duì)照組平均A值-空白組平均A值)×100%。采用直線回歸方法計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 計(jì)算鹽霉素和吉非替尼的聯(lián)合作用效果 根據(jù)中效原理，采用Chou-Talalay聯(lián)用指數(shù)法判定2種藥物的聯(lián)合作用。按中效方程式計(jì)算出不同抑制率時(shí)兩藥的單用和聯(lián)用濃度，公式如下:D=Dm[fa/(1-fa)]1/m;式中D為藥物濃度，Dm為中效濃度，fa為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，m為斜率。2種藥物的聯(lián)用指數(shù)(combination index，CI)的計(jì)算公式如下:CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+a(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2;其中(Dx)1和(Dx)2分別為2種藥物單用時(shí)產(chǎn)生某一效應(yīng)值fa時(shí)的濃度，(D)1和(D)2則是2種藥物聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生相同效應(yīng)fa時(shí)各自所需要的濃度。當(dāng)2種藥物的相互作用為非排斥性時(shí)，a=1;當(dāng)2種藥物的相互作用為排斥性時(shí)，a=0。求出CI值，如果CI＜1，認(rèn)為兩藥物聯(lián)用為協(xié)同作用;如果CI=1，認(rèn)為兩藥聯(lián)用為相加作用;如果CI＞1，則認(rèn)為兩藥聯(lián)用為拮抗作用。

2.4 Annexin V-PI雙染測(cè)定細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549細(xì)胞，每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，設(shè)(0.2 μmol/L)鹽霉素處理組、鹽霉素(0.2 μmol/L)與吉非替尼(0.50 μmol/L)聯(lián)合處理組、單純吉非替尼(0.50 μmol/L)組，以及DMSO對(duì)照組，作用48 h后，消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，棄上清，加入200 μL試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞后，分別加入 10 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，再加入300 μL結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。

2.5 線粒體膜電位、活性氧和胞質(zhì)Ca2+釋放的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2×105cells/well接種至12孔板，設(shè)有上述4組，在6、12、24 h時(shí)收集細(xì)胞，PBS洗滌2遍。500 μL JC-1(10 mg/L)重懸細(xì)胞檢測(cè)線粒體膜電位，500 μL DCFH-DA(5 μmol/L)重懸細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧，10 μmol/L熒光染料Fluo-3AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，37℃避光孵育20 min，PBS洗3次，即刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

2.6 Caspase-3、caspase-8和caspase-9活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2×105cells/well的密度接種至6孔板，設(shè)有上述4組，分別處理6、12、24 h，按照試劑盒說明收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌后重懸于細(xì)胞裂解液中，冰上裂解30 min，4℃下10000×g離心10 min，取上清加入顯色底物(caspase-3底物Ac-DEVD-pNA，caspase-8底物Ac-IETD-pNA，caspase-9 底物 Ac-LEHD-pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，避光孵育4 h，酶標(biāo)儀在波張405 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。

2.7 Western blotting檢測(cè) 處理48 h后，收集并PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白;細(xì)胞色素C測(cè)定是按試劑盒抽提胞漿及線粒體蛋白。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑測(cè)定蛋白濃度，取蛋白50 μg，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液(20 mmol/L Tris pH 7.6，0.1%Tween 20)封閉過夜。兔抗Akt抗體(H-136)、鼠抗人細(xì)胞色素 C、Bcl-2抗體(Santa Cruz)、p-EGFR、p-Akt和 p-ERK 抗體 (Cell Signaling Technology)或GAPDH(Chemicon International)4℃孵育過夜，1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。目的條帶用Image-Pro Plus分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照校正。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 鹽霉素與吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用

鹽霉素與吉非替尼分別以不同濃度單獨(dú)作用于A549細(xì)胞72 h，均顯示抑制增殖作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，見圖1，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。鹽霉素的IC50值為(0.47±0.07)μmol/L，而吉非替尼的 IC50值為(2.93 ±0.13)μmol/L。根據(jù)合用指數(shù)計(jì)算公式，計(jì)算出吉非替尼和鹽霉素合用在不同效應(yīng)(0.90、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.50 和 0.40)時(shí)的 CI分別為 0.473、0.482、0.545、0.667、0.741、0.864、0.938 和 0.949即當(dāng) fa 為 0.90、0.80、0.75、0.65、0.60、0.50 和 0.40時(shí)兩藥合用為協(xié)同作用。

Figure1.Growth inhibitory rates of A549 cells treated with salinomycin and gefitinib at different concentrations，alone or in combination.A:salinomycin;B:gefitinib;C:salinomycin and gefitinib..n=5.*P＜0.05 vs salinomycin alone at corresponding concentration.圖1 不同濃度鹽霉素與吉非替尼單用或合用對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率

2 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

鹽霉素(0.2 μmol/L)或吉非替尼(0.50 μmol/L)分別單獨(dú)作用A549細(xì)胞72 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(11.81±2.27)%和(8.53±2.24)%，顯著高于DMSO對(duì)照組(4.85±2.21)%，P＜0.05;而鹽霉素(0.2 μmol/L)和吉非替尼(0.50 μmol/L)聯(lián)合作用A549細(xì)胞的凋亡率為(26.74±3.59)%，高于單獨(dú)用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。由此可見，聯(lián)合應(yīng)用鹽霉素可增強(qiáng)吉非替尼誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。

Figure2.f Effects of salinomycin and gefitinib，alone or in combination，on apoptosis of A549 cells.圖2 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

3 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響

0.2μmol/L的鹽霉素作用于A549細(xì)胞之后，線粒體膜電位在6 h時(shí)已顯著下降，24 h時(shí)下降至最低，為對(duì)照組的(35.1±3.6)%;細(xì)胞內(nèi)活性氧在6 h時(shí)已顯著升高，24 h時(shí)仍然高于對(duì)照組水平(130.3±5.5)%;細(xì)胞內(nèi)Ca2+在6 h時(shí)已顯著升高，為對(duì)照組的(152.7±5.5)%，24 h時(shí)下降至接近對(duì)照組水平。0.5 μmoL/L吉非替尼單獨(dú)作用對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+沒有影響。鹽霉素與吉非替尼聯(lián)合作用則可進(jìn)一步改變A549細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖3、表1。

Figure3.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on mitochondria membrane potential in A549 cells.圖3 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響

表1 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響Table1.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on mitochondrial membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+in A549 cells(%..n=5)

表1 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響Table1.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on mitochondrial membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+in A549 cells(%..n=5)

＊＊ P ＜0.01 vs Sal;△△P ＜0.01 vs Gef.

2+MMP ROS Ca 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Sal 84.2±5.9 58.3±4.6 32.7±3.9 150.8±5.9 134.5±5.7 127.5±5.6 155.2±5.6 101.8±5.7 99.8±5 Group.7 Sal+gef 74.9±6.0＊＊△△ 46.8±4.5＊＊△△ 21.8±3.9＊＊△△153.0±5.9＊＊△△131.8±5.7＊＊△△116.1±5.6＊＊△△150.3±5.6△△ 99.4±5.7△△ 99.6±5.7△△Gef 100.8±5.8 98.9±5.8 101.2±5.8 99.8±5.5 99.6±5.5 100.9±5.5 100.1±5.5 99.4±5.5 101.4±5.5

4 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞caspase－3、caspase－8和 caspase－9活性的影響

0.2μmol/L鹽霉素處理A549細(xì)胞后，隨著時(shí)間的增加，caspase-3、caspase-8和caspase-9活性增加，呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。這一結(jié)果表明，caspase-3、caspase-8和caspase-9參與了鹽霉素誘導(dǎo)的凋亡途徑。

表2 鹽霉素與吉非替尼單用或合用對(duì)A549細(xì)胞caspase－3、caspase－8和caspase－9活性的影響Table2.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on the activity of caspase-3，caspase-8 and caspase-9 in A549 cells(%..n=5)

表2 鹽霉素與吉非替尼單用或合用對(duì)A549細(xì)胞caspase－3、caspase－8和caspase－9活性的影響Table2.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on the activity of caspase-3，caspase-8 and caspase-9 in A549 cells(%..n=5)

＊＊P ＜0.01 vs Sal;△△P ＜0.01 vs Gef.

GroupCaspase-3 Caspase-8 Caspase-96 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Sal 115.3±5.1 128.7±5.2 134.8±5.2 156.9±5.8 161.6±5.8 159.4±5.8 137.5±5.4 148.0±5.4 152.9±5.4 Sal+Gef 126.0±5.2＊＊△△ 155.1±5.2＊＊△△ 167.4±5.2＊＊△△ 164.3±5.8＊＊△△ 180.2±5.8＊＊△△ 174.1±5.8＊＊△△ 156.8±5.4＊＊△△ 165.6±5.4＊＊△△ 176.7±5.4＊＊△△Gef 102.7±5.1 118.5±5.1 121.8±5.1 110.7±5.7 119.8±5.7 109.6±5.7 108.3±5.3 118.5±5.3 120.8±5.3

5 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞Bcl－2、細(xì)胞色素 C、p－EGFR、p－Akt和 p－ERK蛋白水平影響

鹽霉素(0.2 μmol/L)單獨(dú)作用A549細(xì)胞，雖然對(duì)EGFR、Akt和ERK總蛋白水平無(wú)顯著影響，但是Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而且胞漿細(xì)胞色素C顯著增加，p-EGFR、p-Akt和p-ERK蛋白水平也顯著下降;吉非替尼(0.50 μmol/L)單獨(dú)作用，不僅Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而且p-EGFR、p-Akt和p-ERK蛋白水平下降更明顯，胞漿細(xì)胞色素C增加量少;鹽霉素與吉非替尼聯(lián)合作用，則Bcl-2、p-EGFR、p-Akt和 p-ERK 蛋白水平進(jìn)一步下降，而且胞漿細(xì)胞色素C上升更高，見圖4。這一結(jié)果說明聯(lián)合應(yīng)用鹽霉素可通過多種途徑增強(qiáng)吉非替尼誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。

討 論

本研究結(jié)果顯示，鹽霉素或者吉非替尼單用雖然均顯示對(duì)A549細(xì)胞有不同程度的增殖抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，但它們聯(lián)用則顯示了更強(qiáng)的協(xié)同作用，鹽霉素提高吉非替尼誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡作用。該協(xié)同作用與鹽霉素和吉非替尼各自藥理特性有關(guān)。鹽霉素屬于聚醚類一元羧酸，由白色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是典型的離子載體抗生素，它對(duì)細(xì)胞中的陽(yáng)離子，尤其是K+、Na+和Rb+的親和力特別強(qiáng)，使生物所必需的陽(yáng)離子通過膜上脂質(zhì)屏障的浸透性增強(qiáng)，妨礙細(xì)胞內(nèi)外陽(yáng)離子的傳遞，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)，可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體凋亡途徑[15-17]。本研究顯示鹽霉素能增加細(xì)胞內(nèi)活性氧，降低線粒體膜電位，促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C釋放，使caspase-3、-8和-9酶激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與我們前期研究結(jié)果一致[14]。吉非替尼屬于小分子的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其通過競(jìng)爭(zhēng)性地與EGFR酪氨酸激酶催化區(qū)域中的Mg-ATP位點(diǎn)結(jié)合，抑制酪氨酸激酶磷酸化，阻斷EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞凋亡[18-22]。EGFR屬于Ⅰ型生長(zhǎng)因子家族，具有酪氨酸激酶活性，可通過下游多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，如有促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/ERK、PI3K/Akt及 Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號(hào)通路等。許多研究證實(shí)EGFR信號(hào)通路參與了腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、血管生成、細(xì)胞增殖和凋亡抵抗等。本研究顯示，吉非替尼單用則主要通過抑制p-EGFR、p-Akt和p-ERK蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，而對(duì)胞漿細(xì)胞色素C、caspase-3、-8和-9酶活性影響較少。所以，鹽霉素與吉非替尼合用具有協(xié)同作用。這與2種藥物在作用機(jī)理上具有互補(bǔ)作用密切相關(guān)。該結(jié)果為改善肺腺癌臨床治療方法提供新的依據(jù)。但如何應(yīng)用鹽霉素于肺腺癌臨床治療還有待進(jìn)一步研究。

Figure4.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on the protein levels of Bcl-2，cytochrome C，p-EGFR，p-Akt，p-ERK，EGFR，Akt and ERK in A549 cells.Con:control..n=5.*P＜0.05 vs Con.圖4 鹽霉素與吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞中Bcl－2、cytochrome C、p－EGFR、p－Akt、p－ERK、EGFR、Akt和ERK蛋白水平的影響

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