肖永光 王賢燦

肖永光，王賢燦

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢，430060

冠心病的外科治療策略是利用血管橋重建心肌血供，靜脈是目前較為常用的血管橋。但移植后靜脈橋常因管壁增厚和管腔狹窄使臨床遠期療效不佳［1］。造成這種結(jié)果的主要原因是血管壁中膜平滑肌細胞增生及其大量細胞外基質(zhì)的堆積，因而如何抑制血管平滑肌細胞增生和減少細胞外基質(zhì)生成成為緩解靜脈橋狹窄的關(guān)鍵［2］。

吲哚胺2，3－過氧化酶（Indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO）是肝外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，其活性表達可引起細胞微環(huán)境中色氨酸分解代謝增強，從而抑制T細胞增殖。因此，它是一種潛在的免疫抑制酶，可以引起腫瘤的逃避和自體免疫耐受［3，4］。還有研究［5］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮源性IDO可以在調(diào)節(jié)血流穩(wěn)定方面起到一定作用。但IDO對移植靜脈橋發(fā)生狹窄有無影響，目前尚無報道。本文探討內(nèi)皮源性IDO對移植靜脈橋狹窄的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

成年長耳大白兔32只（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），體重2.0～2.5 Kg，雌雄不限。隨機分為實驗組和對照組，每組16只。實驗組為內(nèi)皮高表達IDO靜脈橋組，對照組僅注射質(zhì)粒載體，其余條件相同。

1.2 頸靜脈橋的制備

先將含有人IDO 基因（human IDO，hIDO）的質(zhì)粒（哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院劉漢忠教授惠贈）導(dǎo)入大腸桿菌，然后將大腸桿菌置入500 ml含氯霉素的Terrific肉湯培養(yǎng)基（預(yù)加溫至37℃），于37℃振搖培養(yǎng)（搖床轉(zhuǎn)速300r／min）16h，最后收集并裂解細菌，分離和純化質(zhì)粒。在靜脈橋移植前24h從實驗組大白兔耳緣靜脈注入質(zhì)粒，即可獲取血管內(nèi)皮高表達IDO的頸靜脈橋［6］。對照組質(zhì)粒載體內(nèi)不含IDO基因，其它培養(yǎng)條件同實驗組靜脈橋制備。

1.3 自體靜脈橋移植

各組實驗動物均用4%戊巴比妥鈉（30 mg／Kg）耳緣靜脈注射麻醉，并按1 mg／Kg劑量注入肝素抗凝。左頸部備皮，活力碘消毒。鋪無菌單，以胸鎖乳突肌中點為中心，作一2cm縱行皮膚切口。鈍性分離皮下組織，顯露左頸總動脈和頸外靜脈。阻斷頸外靜脈近、遠兩端，剪取長約2cm血管橋，置于含肝素和罌粟堿的冰生理鹽水中待用。頸外靜脈兩斷端分別予以結(jié)扎。于頸總動脈近、遠兩端分別阻斷，中間橫斷，在10倍手術(shù)顯微鏡下，用9－0醫(yī)用無損傷線將動脈兩端分別與靜脈橋行端端吻合。吻合完畢，松開近端血管夾，排氣，結(jié)扎縫線，最后松開遠端血管夾。若吻合口滲血，用棉簽壓迫止血。吻合完畢見靜脈橋明顯擴張、觸之可及震顫，表示靜脈橋通暢。術(shù)畢依層縫合，關(guān)閉切口。置動物于室溫，麻醉自然清醒。術(shù)畢每日觸摸頸部，靜脈橋處可及震顫。兩組動物均成功制備和移植自體靜脈橋。

1.4 標(biāo)本采集和處理

術(shù)后兩組動物常規(guī)飼養(yǎng)，手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第7、14及21天隨機抽取兩組動物各4只，用上述相同方法麻醉后沿原切口切開，游離靜脈橋，清除靜脈壁外附著組織，阻斷兩端吻合處，向腔內(nèi)注入適量10%甲醛液，10 min后切取移植靜脈橋進行常規(guī)病理切片，HE染色及PCNA免疫組化染色。實驗動物均放血處死。

1.5 觀察指標(biāo)

（1）HE染色后，以內(nèi)彈力膜為界，用IPP計算機圖像分析系統(tǒng)測量移植靜脈橋中膜平均厚度。（2）計算靜脈橋中膜平滑肌細胞核PCNA染色陽性指數(shù)（PCNA指數(shù)為鏡下100個細胞中PCNA陽性細胞所占的百分率）。PCNA陽性細胞胞核呈棕色或深棕色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 兩組中膜厚度比較（n均＝4）

2 結(jié) 果

兩組移植靜脈橋均有不同程度增厚，且有隨移植時間延長而增加的趨勢。移植后第21天，實驗組靜脈橋中膜厚度測值（62.50±3.40μm）明顯低于對照組（112.30±7.80μm）（P＜0.05，圖1）。

但在術(shù)后靜脈橋持續(xù)增厚時，兩組中膜平滑肌細胞PCNA陽性指數(shù)由上升（術(shù)后第14天）轉(zhuǎn)為下降趨勢，術(shù)后第21天，實驗組PCNA陽性指數(shù)（14.00%±3.40%）明顯低于對照組（22.30%±5.40%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 兩組PCNA陽性指數(shù)比較（n均＝4）

3 討 論

研究［7］表明，靜脈橋發(fā)生狹窄的主要原因是血管壁中膜平滑肌樣細胞增生并分泌大量細胞外基質(zhì)在血管壁內(nèi)堆積，從而形成移植橋血管管腔狹窄，導(dǎo)致閉塞。內(nèi)皮源性IDO通過消耗血管壁中膜平滑肌細胞內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP），造成這些細胞內(nèi)能源耗竭，使高爾基復(fù)合體內(nèi)的能量利用減少，從而減少蛋白合成，抑制細胞增殖的發(fā)生［8］。

本文結(jié)果顯示，在靜脈橋移植后兩組靜脈橋均有不同程度地增厚，移植后第21天實驗組靜脈橋中膜厚度明顯低于對照組，PCNA陽性指數(shù)明顯下降，表明內(nèi)皮源性IDO能夠有效緩解靜脈橋狹窄的發(fā)生。

本實驗結(jié)果還顯示靜脈橋在術(shù)后呈持續(xù)增厚時，平滑肌細胞的PCNA陽性指數(shù)從術(shù)后第14天開始呈下降趨勢，且在實驗組和對照組均出現(xiàn)上述現(xiàn)象，提示此時導(dǎo)致內(nèi)膜增厚的主要原因并非血管平滑肌細胞的增殖，而可能是由細胞外基質(zhì)堆積所致。另外觀察到，兩組靜脈橋內(nèi)膜和外膜PCNA陽性細胞較少，其厚度變化不明顯，可見橋靜脈管腔狹窄的主要原因是血管中膜增厚［9］。

綜上所述，內(nèi)皮源性IDO能夠有效緩解靜脈橋狹窄的發(fā)生，其對較晚期靜脈橋的狹窄除抑制平滑肌細胞增殖外，還可抑制蛋白質(zhì)合成，減少細胞外基質(zhì)的堆積，從而起到緩解靜脈狹窄的作用。

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5 Liu H，Visner GA.Applications of sleeping beauty transposons for nonviral gene therapy［J］.IUBMB Life，2007，59（6）：374～379.

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