張 偉 李福榮

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

芹菜籽，為傘形科植物芹菜的成熟果實(shí)，取自芹菜小小的花朵中，顏色多為棕褐色或深棕色，含桉油醇、磷甲氧基酚、傘花內(nèi)酯、芹菜素、亞麻酸、揮發(fā)性油脂、黃酮、硼、礦物質(zhì)(鈣、鎂、鈉、鋅等)。維吾爾醫(yī)生認(rèn)為芹菜籽有散氣、消腫、利尿、開(kāi)通阻滯、降血壓等功效，在維吾爾藥中主要用于治療高血壓、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氣滯性子宮炎、腹水、腎臟等疾病［1］。有報(bào)道證實(shí)芹菜籽有強(qiáng)大的抗癌作用，對(duì)多種癌細(xì)胞均具有殺傷作用［2－3］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［4－5］，芹菜籽油中所含有的檸檬烯成分具有消炎、抗氧化、利膽等作用，而且是強(qiáng)抗癌物質(zhì)，可以預(yù)防和治療化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌等［6－7］。近年來(lái)天然藥物的抗癌作用研究成為熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)就芹菜籽粗提物對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3干預(yù)作用的機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，旨在為芹菜籽應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板(Costar公司)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibic公司)，10%新生牛血清(杭州四季青公司)，流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè) Annexin V-FITC雙染色及細(xì)胞周期PI檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)等。

1．2 方法

1．2．1 芹菜籽提取物(CSE)提取方法 應(yīng)用CO2超臨界萃取法(SFE-CO2)提取芹菜籽有效成分，芹菜籽300 g烘干、粉碎、過(guò)篩(60目)，投入萃取釜中，先后采用一級(jí)萃取、二級(jí)分離的階梯法萃取。設(shè)定萃取器壓力25 MPa，溫度45℃，萃取時(shí)間為2 h，再進(jìn)入冷凍、高壓泵、再冷凍循環(huán)。萃取得到半固體深褐色油狀物，稱重67 g。

1．2．2 MTT檢測(cè)CSE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 卵巢癌細(xì)胞SKOV-3傳代接種于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)瓶中，置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2～3天傳代一次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按密度0．4×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板，無(wú)血清培養(yǎng)24 h。分別加入終濃度為 5，0．5，0．05 μg/L CSE高、中、低劑量組。干預(yù)12 h后加入MTT溶液，4 h后加入DMSO溶液，10 min后在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1．2．3 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 上述分組細(xì)胞經(jīng)CSE干預(yù)處理12 h后收集細(xì)胞，設(shè)定細(xì)胞密度為1×105/ml，PBS洗2次，吸入490 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC及 5 μl PI(濃度250 μg/ml)，混勻避光溫育10 min，立即上流式細(xì)胞儀分析(Ex=488 nm;Em=530 nm)檢測(cè)凋亡率，光源為488 nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC被激發(fā)后發(fā)射綠色熒光，PI散出紅色熒光。

1．2．4 流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期 上述分組細(xì)胞經(jīng)CSE干預(yù)處理12 h后收集細(xì)胞，設(shè)定細(xì)胞密度為2×106/ml，70%冷乙醇緩慢加入固定細(xì)胞過(guò)夜，冷 PBS 洗2 次，加入 PI 5 μl，RNase 50 μg/ml，0．1%Triton X-100，0．1 mmol/L EDTA(Na)2。置黑暗處反應(yīng)1 h后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，氫離子激光)，以multcycle DNA分析軟件包分析細(xì)胞周期。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13．0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行oneway ANOVA分析及LSD兩兩比較。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 應(yīng)用MTT方法觀察分析芹菜籽提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖活性的抑制作用 應(yīng)用三個(gè)濃度的CSE處理后，細(xì)胞吸光度OD值低于空白對(duì)照組(P＜0．01)，細(xì)胞增殖活性顯著降低，且此效應(yīng)呈濃度依賴性(P ＜0．01，表1)。

表1 MTT檢測(cè)CSE對(duì)細(xì)胞活性的影響(±s，n=8)

表1 MTT檢測(cè)CSE對(duì)細(xì)胞活性的影響(±s，n=8)

注:＊＊P ＜0．01 vs對(duì)照組，*P ＜0．01 vs對(duì)照組，#P ＜0．01 vs低劑量組。

分組 MTT(OD值)1．605 ±0．157 CSE(5 μg/L) 0．329 ±0．012＊＊CSE(0．5 μg/L) 1．437 ±0．088*#CSE(0．05 μg/L) 1．645 ±0．108對(duì)照組#

2．2 CSE對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞周期的影響

DNA倍體分析結(jié)果顯示CSE可促進(jìn)癌細(xì)胞細(xì)胞周期停滯。對(duì)各組G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞分布比例分析，與未加藥物的空白對(duì)照組相比，各CSE處理組S期細(xì)胞百分比降低(P＜0．01);而G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高(P＜0．01)，具體結(jié)果見(jiàn)流式細(xì)胞儀PI染色DNA倍體分析結(jié)果(圖1)，及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(圖2)。

圖1 流式細(xì)胞儀PI染色DNA倍體分析結(jié)果

圖2 CSE對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

2．3 CSE對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3凋亡的影響

按照Annexin V-FITC/PI雙熒光染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)散點(diǎn)圖相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，各CSE處理組的早期與晚期凋亡率之和顯著增加(P＜0．01)，且藥物三個(gè)濃度的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性的增加效應(yīng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01，圖3)。

圖3 CSE對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)于抗腫瘤藥物研究的重視加強(qiáng)，越來(lái)越多的抗腫瘤藥物被研究和開(kāi)發(fā)出來(lái)，由于化學(xué)類藥物一定的毒副作用限制了它們的廣泛使用和療效，所以尋找安全無(wú)毒的抗癌中草藥顯得尤為重要。我國(guó)的中醫(yī)中藥研究歷史悠久，作為有著豐富的中藥資源的國(guó)家，我們?cè)谥兴幰约坝行С煞謱?duì)于腫瘤作用及其機(jī)制上已經(jīng)有了大量的研究。既往已有研究顯示，有很多的中藥都存在著不同程度的抗癌作用，例如錢士輝等［8］的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，陳皮提取物的劑量在 2．5，5．0，10．0 mg/(kg·d)時(shí)對(duì)小鼠移植性腫瘤Heps的抑制率分別達(dá)到39．38%，54．42%，49．56%。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(RFS-2000)可以有效治療胰腺癌［9］，同時(shí)它又是從中國(guó)喜樹(shù)中所獲得的一種有效成分。中藥單體淫羊藿苷通過(guò)下調(diào)白血病細(xì)胞HL260端粒酶的活性來(lái)達(dá)到抗腫瘤作用，并且具有一定的時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系，作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抗癌作用加強(qiáng)［10］。

細(xì)胞凋亡在生物的發(fā)育、疾病的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的治療中有著重要的作用?，F(xiàn)已明確，大多數(shù)抗腫瘤藥物都可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且其效能與腫瘤細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生凋亡的內(nèi)在活性有關(guān)［11］。細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，細(xì)胞周期的長(zhǎng)短取決于G0/G1期，S期阻滯可使細(xì)胞周期延長(zhǎng)，增殖速度減慢。細(xì)胞通過(guò)兩個(gè)限制點(diǎn)(G1/S期限制點(diǎn)和G2/M期限制點(diǎn))保證細(xì)胞的忠實(shí)復(fù)制［12］。藥物引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯后，修復(fù)成功的細(xì)胞向分化方面發(fā)展，繼續(xù)進(jìn)入增殖周期，不能修復(fù)者則進(jìn)入凋亡途徑。

本研究采用MTT計(jì)數(shù)細(xì)胞吸光度、檢測(cè)芹菜籽提取物具有誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的作用，并證實(shí)其作用具有劑量依賴性效應(yīng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明藥物干預(yù)后癌細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期結(jié)果顯示，S期細(xì)胞數(shù)目減少。其機(jī)制可能出現(xiàn)細(xì)胞周期在G0/G1→S期的阻滯，生長(zhǎng)發(fā)育停滯并進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但是其分子機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的研究。隨著人們對(duì)芹菜籽揮發(fā)油研究的不斷深化，芹菜籽揮發(fā)油的應(yīng)用范圍也必將進(jìn)一步擴(kuò)大，本實(shí)驗(yàn)為芹菜籽的進(jìn)一步深入研究提供了實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

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