張新事，付淑軍，林小燕，李玉娟（1.北京理工大學生命學院，北京100081；.國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院/瀚盟生物技術（天津）有限公司，天津 300457）

伏立康唑（Voriconazole）為美國輝瑞公司開發(fā)的第2代三唑類抗真菌藥物，2002年8月在美國首次上市。伏立康唑口服和靜脈給藥均有很好的抗真菌活性，對細菌、霉菌和酵母菌均有強抑菌作用，是治療深部真菌感染首選藥[1～4]。目前臨床上主要使用的是伏立康唑靜脈輸注用凍干粉末。由于伏立康唑水溶性很差，因此該制劑中加入了大量硫代丁基醚-β-環(huán)糊精進行增溶，但也導致可能存在給藥時刺激性強、易發(fā)生溶血等不良反應[5]。北京理工大學生命學院生物分析實驗室采用獨特的乳化技術，利用伏立康唑可在油水兩相中形成非均勻的水包油型液體分散體系的特點，將其制成靜脈注射用乳劑。由于不含大量的增溶劑，可減少由此而導致的溶血等不良反應，還可降低給藥時產(chǎn)生的刺激性，減少藥物的毒副作用。

鑒于伏立康唑乳劑基質(zhì)的復雜性，干擾成分多，因此有必要建立靈敏、專屬的方法進行主藥及其有關物質(zhì)含量測定。本文采用高效液相色譜（HPLC）法，建立了伏立康唑乳劑的含量測定方法。結(jié)果表明，該方法簡便、準確，專屬性強，可用于伏立康唑乳劑的含量測定及其有關物質(zhì)的控制。

1 儀器與試藥

HPLC系統(tǒng)，包括LC-10AT輸液泵、SPD-10A紫外檢測器（日本島津公司）；N-2000色譜工作站（浙江大學）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純。

伏立康唑?qū)φ掌罚ㄈf特制藥（海南）有限公司，批號：20100303，純度：99.9%）；伏立康唑乳劑（北京理工大學生命學院生物分析實驗室自制，批號：100701、100702、100703，規(guī)格：100 mg∶25 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水-乙酸（40∶60∶0.25，V/V/V），流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：256 nm；靈敏度：0.01 AUFS；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。理論板數(shù)按伏立康唑峰計應不低于1 500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白基質(zhì)溶液：精密量取本品的空白基質(zhì)0.1 mL（按照乳劑處方所用賦形劑的種類和用量制備，但不含伏立康唑），置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇5 mL后振搖，再以無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液：精密稱定減壓干燥至恒重的伏立康唑?qū)φ掌?.00 mg，加無水乙醇溶解并逐級稀釋成濃度為100.0、50.0、20.0、10.0、5.00、2.00、1.00 μg·mL－1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液：精密量取本品0.1 mL（相當于伏立康唑0.4 mg），置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇5 mL后振搖，再以無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 樣品破壞溶液：精密量取本品0.1 mL（相當于伏立康唑0.4 mg）5份，各置于25 mL容量瓶中，其中3份分別加入0.1 mol·L－1氫氧化鈉、0.1 mol·L－1鹽酸、3%雙氧水各0.2 mL，室溫放置2 h，加無水乙醇5 mL后振搖，再以無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得堿、酸和氧化破壞后樣品溶液；另2份置于25 mL容量瓶中，分別于4 500 lx條件室溫下放置5 d及（40±5）℃下放置5 d，加無水乙醇5 mL后振搖，再以無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得光照破壞溶液和高溫破壞樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

取空白溶劑（無水乙醇）、空白基質(zhì)、對照品和供試品溶液進樣分析，色譜見圖1；各破壞后樣品溶液色譜見圖2。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.空白基質(zhì)；C.對照品；D.供試品；Ⅰ、Ⅱ.來自賦形劑的干擾峰；Ⅲ.伏立康唑；Ⅳ.可能的降解產(chǎn)物Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.blank matrix；C.substance control；D.test sample；Ⅰ，Ⅱ：interfering peaks from excipients；Ⅲ：voriconazole；Ⅳ：potential degradation product

圖2 破壞樣品溶液的高效液相色譜圖A.酸破壞樣品溶液；B.堿破壞樣品溶液；C.光照破壞樣品溶液；D.高溫破壞樣品溶液；E.氧化破壞樣品溶液；Ⅰ、Ⅱ.來自賦形劑的干擾峰；Ⅲ.伏立康唑；Ⅳ.可能的降解產(chǎn)物Fig 2 HPLC chromatograms of destroyed sample solution A.solution destroyed by acid；B.solution destroyed by alkal；C.solution destroyed by light；D.solution destroyed by heat；E.solution destroyed by oxidation；Ⅰ，Ⅱ.interfering peaks from excipients；Ⅲ.voriconazole；Ⅳ.potential degradation product

由圖1可見，在空白溶劑的色譜圖（圖1A）中未發(fā)現(xiàn)有干擾峰的存在；而在空白基質(zhì)的色譜圖（圖1B）中含有2個雜質(zhì)峰，其保留時間分別為5.2、6.0、12.4 min（注：3個化合物尚未鑒定）；在對照品的色譜圖（圖1C）中，伏立康唑的保留時間為15.9 min。表明溶劑及乳劑中的賦形劑均不干擾伏立康唑的測定。

由圖2可見，伏立康唑?qū)φ掌啡芤航?jīng)堿破壞后出現(xiàn)保留時間為6.7 min的色譜峰，另外本品在酸、氧化、光照及高溫條件下均出現(xiàn)保留時間為6.7 min的色譜峰，尤其在堿、氧化和高溫破壞樣品中含量較高，因此可確定其為伏立康唑乳劑中的有關物質(zhì)。比較上述色譜圖可知，乳劑中賦形劑、降解產(chǎn)物、伏立康唑以及溶劑色譜峰彼此之間均分離良好。因此本方法對伏立康唑乳劑中伏立康唑的測定具有良好的專屬性。

2.4 線性關系考察

精密稱定減壓干燥至恒重的伏立康唑?qū)φ掌?.00 mg，加無水乙醇溶解并逐級稀釋成濃度為100.0、50.0、20.0、10.0、5.00、2.00、1.00 μg·mL－1的溶液，各取20 μL，依次注入液相色譜儀，記錄色譜。以伏立康唑的色譜峰面積（y）對濃度（x）回歸，計算線性回歸方程為y＝2×106x+5 735.5（r＝0.999 9），結(jié)果表明伏立康唑檢測濃度線性范圍為1.00～100.0 μg·mL－1。

2.5 檢測限與定量限試驗

稱取伏立康唑?qū)φ掌愤m量，以無水乙醇溶解并稀釋到一定濃度，吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。分別以伏立康唑色譜峰響應值約為基線噪音的3倍（信噪比為3）和10倍（信噪比為10）時的進樣濃度為檢測限和定量限。結(jié)果，檢測限為0.3 ng·mL－1，定量限為1.0 ng·mL－1。

2.6 穩(wěn)定性試驗

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，制得后即放置在室溫條件下，分別于第0、2、5、10、25 h取樣20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，計算其RSD＝0.71%。表明供試品溶液室溫放置25 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同一批號的樣品，制備成供試品溶液，連續(xù)進樣測定6次，結(jié)果RSD＝0.33%，表明本方法重復性良好。

2.8 中間精密度試驗

取同一批號的樣品，由2名分析者，分別在2 d內(nèi)在2臺不同的色譜儀上進行含量測定，考察中間精密度，結(jié)果RSD＝1.80%，表明本方法中間精密度良好。

2.9 回收率試驗

平行量取已知含量的乳劑9份，每份0.10 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次加入低、中、高3種濃度的對照品溶液5.0 mL，制備供試品溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并按外標法以峰面積計算加樣回收率。結(jié)果，低、中、高3個濃度的平均加樣回收率為98.8%，RSD＜2%，表明本方法具有良好的準確度，詳見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery test

2.10 樣品中主藥含量測定

精密量取本品0.10 mL（相當于伏立康唑400 μg），置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇5.0 mL，振搖，繼續(xù)以無水乙醇稀釋到刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。取上述供試品溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量。結(jié)果，3批伏立康唑乳劑的含量測定結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表2。

表2 3批樣品含量測定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of 3 batches of samples

2.11 樣品中有關物質(zhì)含量測定

量取本品1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇5.0 mL，振搖，以無水乙醇稀釋到刻度，搖勻；以0.45 μm微孔濾膜過濾，即得約含160 μg·mL－1伏立康唑的供試品溶液。另精密量取適量對照品貯備液，以無水乙醇稀釋制成約含1.6 μg·mL－1伏立康唑的對照溶液。照“2.1”項下的色譜條件，量取對照溶液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～20%；精密量取供試品溶液和對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)的峰面積之和不得大于對照液中主成分峰面積的3倍（3.0%）。經(jīng)檢測，3批伏立康唑乳劑的有關物質(zhì)含量分別為1.13%、1.03%和1.02%。

3 討論

在前期試驗中，筆者分別考察了2種比例流動相系統(tǒng)乙腈-水-乙酸（55∶45∶0.25，40∶60∶0.25，V/V/V）對分析的影響。當以前者為流動相時，伏立康唑的保留時間為7.0 min，分析時間適中。但在進行相關物質(zhì)的影響因素試驗時，發(fā)現(xiàn)分離度較差，峰形不對稱，因此繼續(xù)對流動相的比例進行了優(yōu)化，最后確定后者為流動相。在此條件下，伏立康唑與雜質(zhì)能夠完全分開，峰形對稱，伏立康唑的保留時間為15.9 min。在上述色譜條件下，主要存在3個可能的雜質(zhì)峰，其與伏立康唑以及彼此之間的分離度均大于1.5，符合有關要求。

在伏立康唑乳劑中，伏立康唑被包合于水包油的乳粒中，若要對其進行含量測定，首先應采用適當?shù)挠袡C溶劑實施破乳，釋放伏立康唑。本試驗考察了用于破乳的多種有機溶劑，包括甲醇、無水乙醇、乙腈等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無水乙醇的破乳效果最好，并且適用于隨后的HPLC分析。

伏立康唑乳劑中含有精制蛋黃磷脂、油酸、注射用大豆油、甘油、維生素E等賦形劑，基質(zhì)組成相對復雜，可能給含量及其有關物質(zhì)測定帶來干擾。文獻[4]報道方法均為原料藥或注射劑的分析檢測方法，與乳劑相比，其基質(zhì)相對簡單，干擾較少；而本實驗室制備的乳劑基質(zhì)復雜，采用文獻報道方法干擾多，不適用于本研究。因此，本試驗成功建立了用于伏立康唑乳劑的主藥及有關物質(zhì)含量測定的HPLC法，經(jīng)方法驗證，確認本方法準確可靠、專屬性強，適用于伏立康唑乳劑的快速分析。

[1]尚茂林.抗真菌新藥——伏立康唑[J].中國藥房，2007，18（19）：1 505.

[2]張志華，易 鴻，何周康，等.HPLC-MS/MS法測定伏立康唑的血藥濃及其在生物等效性研究中的應用[J].中南藥學，2009，7（12）：889.

[3]昌 盛.伏立康唑[J].中國藥物化學雜志，2007，17（3）：197.

[4]吳良法.反相高效液相色譜法測定伏立康唑的含量[J].中國藥房，2007，18（1）：58.

[5]官東秀，馮祚臻，俸小平，等.伏立康唑藥物不良反應文獻分析[J].齊魯藥事，2009，28（8）：507.