王 超，潘建偉

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

內吞作用(endocytosis)又稱入胞作用，是通過質膜的變形運動將細胞外物質轉運至胞內的過程.內吞作用之所以讓很多生物學家沉迷了大半個世紀，是因為其具有多種重要的生物學功能，包括抗原呈遞、養(yǎng)分攝取、凋亡細胞清除、病原體入侵、質膜蛋白(如受體蛋白和運輸?shù)鞍?的水平調控、胞內外信號傳導等等［1-2］.

根據(jù)所轉運的物質大小和轉運機制的不同，可將內吞作用大致分為五大類［3］:1)吞噬作用(phagocytosis):主要吸收大顆粒物質;2)大胞飲作用(macropinocytosis):主要吸收液相物質;3)網(wǎng)格蛋白介導的內吞(clathrin-mediated endocytosis，CME):吸收一些小分子物質或病原體，或調控質膜蛋白水平，需要動力蛋白(dynamin)的參與;4)小窩蛋白介導的內吞(caveolin-mediated endocytosis):功能與3)相似，也需要動力蛋白的參與;5)不依賴于動力蛋白的內吞(dynamin-independent endocytosis):這類內吞的功能與3)和4)相似，但機理仍不清楚.關于動植物內吞的研究結果表明，網(wǎng)格蛋白介導的內吞是受體介導內吞的主要方式之一，在質膜蛋白內吞及胞內外信號傳導過程中起著重要的調控作用［4-5］.因此，該途徑成為動植物分子細胞生物學的研究熱點之一.本文著重介紹了最近幾年動植物中網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑的一些新進展.

1 網(wǎng)格蛋白復合體的組成及其功能

自從1976年網(wǎng)格蛋白首次在動物細胞中發(fā)現(xiàn)［4］后，至今，網(wǎng)格蛋白在動物細胞和酵母中已得到很好的鑒定.已知動物中有一個網(wǎng)格蛋白重鏈基因(clathrin heavy chain，CHC)和2個輕鏈基因(clathrin light chains，CLCs)，而酵母中編碼CHC和CLC的基因均為單拷貝基因［6］.網(wǎng)格蛋白是由3條重鏈和3條輕鏈組成的三腳架結構，輕鏈與重鏈的C端相互結合.重鏈是三腳架結構的主要骨架，輕鏈則用于調節(jié)網(wǎng)格蛋白籠型結構的組裝和拆解.重鏈長約47.5 nm，厚約2 nm，由1 670多個氨基酸組成，可分為6個部分:N端區(qū)域、腳踝區(qū)、遠端腿、膝、近端腿、三聚作用區(qū)域(又叫做hub)，N端區(qū)域由包括7個兩葉狀的β螺旋構成，其他部分是由多個串聯(lián)的α螺旋構成.輕鏈與重鏈的近端腿相互結合，多個三腳架結構相互結合形成六邊形或五邊形的網(wǎng)格，多個網(wǎng)格組成一個籠型結構.網(wǎng)格蛋白(clathrin)因此得名.在細胞內，3條輕鏈 CLCs分別與3條重鏈CHCs的HUB區(qū)形成一個三腳架的復合體，再與質膜內吞起始位點結合，共由36或60個三腳架復合體形成一個由12個五邊形和若干個六邊形組成的籠形結構［7］，把內陷質膜包裹在籠形結構中，其他輔助蛋白通過網(wǎng)格進入籠形結構中行使各自的生物學功能［6，8］.

重鏈CHC起到一個復合體腳手架的作用，而輕鏈CLC的作用則是調控復合體的裝配與穩(wěn)定性［4-5］.復合體在質膜上形成籠形結構即內吞小窩(pits)后，輕鏈暴露在小窩外，能與細胞質中的一些輔助因子如鈣離子、鈣調蛋白、Hsp70(uncoating ATPase)等接觸進一步調控小窩的生物學功能［9-10］.輕鏈在體內外均能被磷酸化.離體實驗表明，輕鏈能夠阻止網(wǎng)格蛋白重鏈的自由裝配［11］.暗示輕鏈具有多種網(wǎng)格蛋白復合體的調控作用.

網(wǎng)格蛋白復合體在細胞內外物質轉運中起到關鍵性調控作用.網(wǎng)格蛋白包被的小窩(clathrincoated pits，CCPs)在質膜、反式高爾基體網(wǎng)絡TGN(trans-Golgi network)、內體(endosome)等細胞器之間的貨物轉運具有貨物選擇性作用.包裹貨物和部分質膜的小窩通過質膜內陷從細胞膜上脫離后進入細胞質，形成網(wǎng)格蛋白包被小泡(clathrin-coated vesicles，CCVs).小泡上的包被迅速脫離，使得網(wǎng)格蛋白復合體重新回到質膜上，同時，包裹貨物的小泡與內體融合將貨物轉運到內體中，內體通過不同的轉運途徑將貨物運輸?shù)讲煌哪康牡?

網(wǎng)格蛋白除了介導膜蛋白等貨物進行內吞外，還具有多種生物學功能，如生長因子和受體的內吞、病原體的入侵、突出的傳遞等［12］.最近的研究表明，在有絲分裂過程中，網(wǎng)格蛋白可與紡錘體結合，提高紡錘體的穩(wěn)定性，以促進染色體的聯(lián)會.另外，網(wǎng)格蛋白可與微管或者微管相關蛋白直接結合來穩(wěn)定著絲粒［13］.在細胞有絲分裂過程中，網(wǎng)格蛋白包被的小泡連續(xù)形成，暗示著有絲分裂馬上要結束［13］.這些研究表明，網(wǎng)格蛋白參與多種細胞生物學過程，對細胞生長發(fā)育、分化和環(huán)境響應具有重要的生物學功能［14］.

2 接頭蛋白復合體的組成及其功能

在網(wǎng)格蛋白介導的內吞過程中，接頭蛋白(adaptor proteins，APs)主要負責貨物蛋白的分揀(cargo protein sorting)，網(wǎng)格蛋白的招募(recruitment)、裝配和拆卸，以及輔助蛋白的招募等［15］.接頭蛋白與質膜受體蛋白等貨物蛋白結合后，接頭蛋白才可招募網(wǎng)格蛋白和一些輔助蛋白因子.

目前已知有2類接頭蛋白分子［16-17］.第一類是最早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典接頭蛋白，主要有4種:AP1，AP2，AP3和AP4，均為4個亞基組成的異源四聚體.AP1復合體主要作用于TGN的貨物分揀;AP2復合體作用于質膜貨物分揀;AP3復合體可能作用于高爾基體至溶酶體之間的運輸過程中的貨物分揀;AP4復合體，可能與TGN有關，目前機理尚不清楚［18-19］.目前，對AP2的研究相對較為深入，它主要作用于網(wǎng)格蛋白介導膜內吞與貨物分揀.AP2復合體由2個大亞基α和β2，1個中亞基μ2和1個小亞基σ2組成.這個復合體可以分為3個區(qū)域:C端是一個大亞基粘合在質膜上的關鍵區(qū)域，N端是小亞基和中亞基構成的核心區(qū)域及α和β2的鉸鏈.AP2大亞基α與質膜上的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol(4，5)-bisphosphate，PtdIns(4，5)P2/PIP2)或磷脂酰肌醇三磷酸(PtdIns(3，4，5)P3/PIP3)相結合［20］.大亞基 β2通過自身含有的網(wǎng)格蛋白結合序列LФxФD/E基序(motif)招募網(wǎng)格蛋白，此基序橫跨β2亞基的鉸鏈區(qū)［17］.中亞基μ2位于2個區(qū)，其N端1/3位于AP2的核心區(qū)域，C端2/3是與貨物分揀直接相關的一段YxxФ序列，C端還有一個磷脂酰肌醇二磷酸的結合位點［21］.當AP2與質膜的PIP2或PIP3結合后，其構象發(fā)生變化，打開μ2亞基的YxxФ序列.有研究表明，這種構象變化需要Ark激酶家族中的AAK1激酶的作用，使得本來μ2-β2相互作用的構象發(fā)生磷酸化讓YxxФ序列得以打開［20］.小亞基 σ2的主要功能是穩(wěn)定復合體［22-23］.

另一類接頭蛋白是一類結構非常簡單的蛋白因子，它們可以連接貨物進入網(wǎng)格蛋白包被的小窩.典型的接頭蛋白如:GGAs［24］，epsins［25］，Hrs和disabled2［26］.這類蛋白也能夠與其他輔助蛋白結合，共同作用于內吞途徑.GGAs是一個選擇性的網(wǎng)格蛋白接頭蛋白，對這些蛋白因子的作用機制仍需進一步研究.

3 動物細胞網(wǎng)格蛋白介導的內吞

通過一些高技術的電子顯微鏡，能在形態(tài)學上觀察到附著在質膜細胞質面的包被.到目前為止，調節(jié)包被的形成和質膜貨物的選擇主要有3類包被復合體:包被蛋白Ⅰ(coat protein-Ⅰ，COP-Ⅰ)、包被蛋白Ⅱ(COP-Ⅱ)和網(wǎng)格蛋白，其中COP-Ⅰ包被與高爾基體和內質網(wǎng)膜有關，COP-Ⅱ包被涉及從內質網(wǎng)到高爾基體的運輸［27］.而網(wǎng)格蛋白包被參與2個重要的運輸過程:1)從質膜內吞到與早期內體(early endosome)融合;2)從反式高爾基網(wǎng)絡TGN內吞到與內體融合［15］.目前，對哺乳動物網(wǎng)格蛋白介導的內吞過程研究得相對比較清楚，主要包括質膜招募網(wǎng)格蛋白、質膜內陷、包被小窩CCPs的形成、包被小泡CCVs的形成和小泡包被的脫離等過程［1］.

3.1 質膜招募

AP2復合體是網(wǎng)格蛋白介導內吞的主要組件，它是質膜蛋白與網(wǎng)格蛋白的連接紐帶，AP2的μ2亞基貨物分揀識別序列YxxФ基序特異性地選擇貨物蛋白，同時，大亞基β2通過網(wǎng)格蛋白結合序列LФxФD/E基序招募網(wǎng)格蛋白.在AP2復合體招募網(wǎng)格蛋白過程中，AP180起著重要的作用.它首先通過其保守區(qū)域N端區(qū)域(ANTH)與質膜上的 PtdIns(4，5)P2 相互作用［28］，然后協(xié)助AP2招募網(wǎng)格蛋白到質膜表面.AP180的C端具有很強的功能特異性，在網(wǎng)格蛋白招募過程中具有重要的生物學功能［29］.

3.2 小窩CCP的形成

在內吞早期，質膜招募網(wǎng)格蛋白除了需要接頭蛋白 AP2外，還需要多個輔助蛋白因子如AP180和epsin1等的協(xié)同作用，才能準確地招募網(wǎng)格蛋白到質膜上，從而促進質膜向內凹陷形成小窩(CCP).AP180除了具有招募網(wǎng)格蛋白的功能外，還具有促進質膜內陷的功能.有研究表明，在果蠅中，敲除AP180的同源基因后導致小窩CCP數(shù)量減少［29］.epsin1也是一個促進質膜內陷的重要蛋白因子.有實驗證據(jù)表明，epsin1和網(wǎng)格蛋白共定位于內陷的質膜中，epsin1先與質膜磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)結合，再與網(wǎng)格蛋白復合體相互作用，促進質膜凹陷［30］.epsinR是 epsin1的一個同源蛋白，它的主要功能是促進囊泡從高爾基體TGN區(qū)運輸?shù)絻润w上［31］.

3.3 小泡CCV的形成

網(wǎng)格蛋白包被的小窩CCP從質膜脫離形成網(wǎng)格蛋白包被的小泡CCV.小窩CCP的形成受2個重要的輔助蛋白因子如兩性蛋白(amphiphysin)和動力蛋白(dynamin)的調控［32］.兩性蛋白結合于小窩莖質膜上，將動力蛋白招募到小窩莖的部位，然后與動力蛋白相互作用，激活質膜切斷的過程.動力蛋白是一個大GTP酶蛋白家族，在動植物和酵母中高度保守，其主要作用是調控小窩CCP從質膜上脫離，形成小泡 CCV［33］.實驗證據(jù)表明，動力蛋白在兩性蛋白的作用下纏繞內吞小窩的莖部位，然后催化GTP水解導致小窩莖部位的斷裂，從而釋放小窩 CCP，形成小泡 CCV［34］.最近的研究發(fā)現(xiàn)，在小泡CCV形成過程中也受另一類小GTP酶如ADP糖基化因子(ADP ribosylation factors，ARFs)及其相關調控因子 GEF(guanine nucleotide exchange factors)和GAPs(GTPase activating proteins)的調控［35］.這些研究表明，小泡CCV的形成過程是一個由多種蛋白因子參與的復雜調控過程.

3.4 小泡包被的脫離

在小泡與早期內體融合之前，網(wǎng)格蛋白必須從小泡上脫離.脫離過程需要 hsc70，auxilin和ATP的參與，以及 miRNA［36］，其可能的作用機制是破壞網(wǎng)格蛋白與接頭蛋白AP2之間的連接，從而釋放網(wǎng)格蛋白［37］.釋放后的網(wǎng)格蛋白通過再循環(huán)(recycling)途徑被招募到質膜內吞起始位點或進入降解途徑.

4 植物細胞網(wǎng)格蛋白介導的內吞

由于植物細胞具有細胞壁和較高的細胞膨壓，因此，20世紀80年代曾經(jīng)針對植物細胞是否存在像動物一樣的內吞及其生理學意義開展過激烈的討論［38］.但隨后的電子顯微鏡觀察表明，在植物細胞中的確存在內吞現(xiàn)象，并且細胞膨壓并沒有阻止內吞的發(fā)生［39］.

在哺乳動物細胞中，酪氨酸磷酸化抑制劑A23通過特異性地抑制貨物蛋白Yxx?序列與AP2亞基μ2的相互作用，從而阻止網(wǎng)格蛋白介導內吞的發(fā)生［40］.最近幾年的藥理學實驗表明，A23也同樣有效地抑制植物細胞發(fā)生內吞［41］.通過免疫電鏡觀察到網(wǎng)格蛋白介導內吞的發(fā)生過程［41］.這些結果暗示，在植物細胞中很可能也存在類似于動物細胞網(wǎng)格蛋白介導的內吞機制.生物信息學分析表明，在擬南芥基因組中存在2個網(wǎng)格蛋白重鏈基因CHCs和3個輕鏈基因CLCs，以及一些重要的內吞調控基因，如編碼AP2復合體亞基，AP180，hsc70，epsin，dynamin 和 amphiphysin等的同源基因［42-43］(見表 1).最近的遺傳學實驗表明:敲除一個CHC基因引起部分胚胎、子葉發(fā)育、生長素極性分布不正常;同時敲除2個CHC基因引起胚胎致死［44］.這些研究結果表明，網(wǎng)格蛋白介導的內吞在植物生長發(fā)育中起著重要的調控作用.

表1 植物網(wǎng)格蛋白、接頭蛋白和一些重要的輔助蛋白

至今，有證據(jù)表明，植物網(wǎng)格蛋白介導的內吞參與調控細胞極性的建立、細胞分裂、細胞壁的形成、根毛和花粉管等的頂端生長、胚胎發(fā)生、配子體發(fā)生、防御和抗逆反應等［45］，暗示網(wǎng)格蛋白介導的內吞是植物細胞膜蛋白內吞的主要途徑，也是植物生長發(fā)育在逆境響應過程中呈現(xiàn)可塑性的重要機制之一.植物生長素是調控植物生長發(fā)育和逆境響應的重要激素之一，其極性運輸方式是其他激素所沒有的.生長素輸出載體PIN在細胞膜上的極性定位決定了生長素的極性流向和梯度分布［46-47］，而生長素的極性流向和梯度分布對植物胚胎和器官的極性發(fā)育、向性生長等重要的生命活動過程中起著重要的作用［48-49］.外源生長素和A23均可有效地抑制PIN蛋白的內吞［50］，暗示外源生長素通過調控網(wǎng)格蛋白的生物學功能來調控PIN蛋白的內吞.這些研究結果表明，網(wǎng)格蛋白介導的內吞在生長素極性運輸中具有重要的調控作用.最近的研究表明，生長素受體abp1突變體中生長素不能抑制PIN蛋白的內吞［51］，同樣說明了生長素調控PIN的內吞是通過調控網(wǎng)格蛋白介導的內吞來實現(xiàn)的.重鏈T-DNA插入單突變體chc2除15%～20%的幼苗出現(xiàn)不正常的子葉外，其余幼苗均表現(xiàn)為野生型表型;chc1-1chc2-1雙突變體引起胚胎致死，從而影響重鏈CHC活體生物學功能的鑒定.然而，植物網(wǎng)格蛋白輕鏈的生物學功能至今仍沒有被鑒定.

5 結論

已知網(wǎng)格蛋白介導的內吞機制是一個相對保守的內吞機制，在動物中已有廣泛、深入的研究，人們對其本身的分子機理已有較深入的了解.盡管已知網(wǎng)格蛋白能夠介導細胞內外的信號轉導和質膜受體的內吞，但細胞通過什么機制來誘導啟動和終止這一重要的生命現(xiàn)象?目前仍不清楚.另外，網(wǎng)格蛋白在細胞藥物選擇性吸收、腫瘤發(fā)生過程中的分子機理仍有待于進一步的研究.

已有大量的實驗證據(jù)表明，在植物細胞中也同樣存在內吞，并且參與調控多個發(fā)育過程.近幾年來，對植物網(wǎng)格蛋白的研究也取得了較大的進展，但與動物相比，仍相對比較落后.在網(wǎng)格蛋白介導的內吞過程中，對內吞貨物的特異性選擇機制仍不清楚，許多重要輔助蛋白因子仍沒有得到鑒定，植物根系是否通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑從土壤中吸收營養(yǎng)物質仍需要進一步的遺傳與分子證據(jù).這些科學問題很可能成為今后幾年植物學研究領域中的新熱點.

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