李家洲 謝明權(quán) 李安興 羅曉春?

(1．華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006;2．中山大學水生經(jīng)濟動物研究所，廣東廣州510275)

輔酶Q(CoQ)，亦稱泛醌，廣泛存在于各種生物膜中，參與多種生命過程．CoQ的首要功能是參與生物呼吸鏈電子的傳遞，將呼吸過程所產(chǎn)生的電子由復合體Ⅰ或復合體Ⅱ傳遞給復合體Ⅲ［1］．除此之外，CoQ還有許多其它重要功能．例如，作為還原型煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(NADH)氧化酶的輔酶，參與胞質(zhì)中煙酰胺腺嘌吟二核苷酸氧化型與還原型比例(NAD+/NADH)的調(diào)節(jié)，從而影響細胞的生長與分化［2］;作為高效抗氧化劑阻止細胞蛋白、脂質(zhì)和DNA被氧化［3］;阻止線粒體膜上大分子轉(zhuǎn)運膜打開從而避免線粒體功能損傷［4］等．依據(jù)苯環(huán)上所結(jié)合的聚異戊二烯側(cè)鏈的聚合度，CoQ可分為 CoQ5、CoQ6、CoQ7、CoQ8、CoQ9、CoQ10等．不同物種依據(jù)其固有的遺傳特性，均能合成特定的CoQ．例如，大腸桿菌合成的是 CoQ8［5］;老鼠體內(nèi)合成的是 CoQ9［6］;人體內(nèi)合成的則是CoQ10［7］．CoQ10在人類健康領域展現(xiàn)出非常巨大的市場前景，受到廣泛關注．CoQ10可作為優(yōu)良的抗氧化劑可消除人體內(nèi)的活性氧［8］．此外，CoQ10還可用于治療心血管疾病［9］、糖尿病［10］、帕金森氏綜合癥［11］等，也可用于緩解一些抑制素(如促黑激素抑制素、生長激素抑制素等)的副作用［12］．

目前，CoQ10生產(chǎn)方法有化學合成法、半合成法和發(fā)酵法，其中發(fā)酵法是目前的主流［13］．發(fā)酵法的關鍵是選育或構(gòu)建高產(chǎn)CoQ10的菌種．目前可用于生產(chǎn)的菌種均經(jīng)過誘變育種法得到，包括農(nóng)桿菌、脫氮副球菌和雨生紅球菌等［14］．雖然大腸桿菌具有許多適于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良性能，但由于其合成的是CoQ8，限制了其在商業(yè)生產(chǎn)CoQ10方面的應用．現(xiàn)代生物分子學技術的快速發(fā)展，使得通過遺傳改造構(gòu)建適于工業(yè)化生產(chǎn)CoQ10的大腸桿菌的構(gòu)想具備了可行性．

能提供ddsA編碼產(chǎn)物聚十異戊二烯焦磷酸合成酶的微生物包括裂殖酵母(Fission yeast)、脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、紅球菌(Rhodobacter sphroides)、放射型根瘤菌［14］．歷史上放射型根瘤菌曾歸入農(nóng)桿菌屬，后根據(jù)表現(xiàn)型和基因型的差異，將其單列成一個屬［15］．日本科學家獲得的CoQ10高產(chǎn)紀錄(760mg/L)就來自于放射型根瘤菌［14］，這證明其酶系統(tǒng)具有高產(chǎn)CoQ10的潛力．本研究選擇放射型根瘤菌作為ddsA來源，將其克隆后通過同源重組替換大腸桿菌的聚八異戊二烯焦磷酸合成酶基因ispB，并強化CoQ合成過程中的關鍵酶，構(gòu)建產(chǎn)CoQ10的大腸桿菌工程菌．

1 材料與方法

1．1 實驗材料

DNA標準物、質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠試劑盒、DNA聚合酶、pMD18T載體、限制性內(nèi)切酶和其它DNA修飾酶購自大連寶生物有限公司;異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、蛋白酶K和細菌基因組提取試劑盒購自北京普博生物技術有限公司;L-阿拉伯糖購自阿拉丁公司;CoQ10標準品購自中國藥品生物制品檢定所;DNA引物由上海生工生物工程有限公司合成;用于高效液相色譜(HPLC)分析的試劑均為色譜純，其它試劑均為分析純．

放射型根瘤菌WSH由江南大學堵國成教授饋贈;其它菌種、pKD3、pKD46、pCP20、pQE30 及其它載體均為華南理工大學廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室保存或構(gòu)建．

1．2 ddsA 基因克隆

放射型根瘤菌WSH經(jīng)搖床培養(yǎng)［16］，按照細菌基因組提取試劑盒說明書從培養(yǎng)液中提取基因組．基因克隆參照文獻［17］．根據(jù)Genebank中Agrobacterium tumefaciens c．58全基因序列中ddsA為參照設計上游引物RDup(CGCGGATCCTTGCCGCACAAGGCATCAGTTT，下劃線處為BamHI酶切位點)和下游引物RDdown(CGCAAGCTTTCAGTTGAGACGCTCGATGCAG，下劃線處為HindⅢ酶切位`點)．利用LA Taq酶進行聚合酶鏈式反應(PCR)，條件為:94℃5min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 70s，30 個循環(huán);72℃5min．PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，凝膠回收純化后進行A－T 克隆，構(gòu)建質(zhì)粒 pMD18ddsA，轉(zhuǎn)化 E．coliDH5α，菌落PCR檢測，送樣測序．

1．3 大腸桿菌BL21 ispB基因置換

利用大腸桿菌red重組系統(tǒng)，對大腸桿菌BL21 ispB基因用放射型根瘤菌ddsA基因置換．根據(jù)ispB基因上下游環(huán)境，設計上游打靶引物D1(CAGCGATGTGCGCGAGGCCGATGAGTGCTTCTCGCCAAGGGGTGTCCGGGATAGTTCCTATTCCGAAGT，下劃線處為pkD3 Cmr基因引物)和下游打靶引物D2(TGCCTTTGTTCACAGTAAGGTAATCGGGGCGAAAAGCCCGGCTTTTGCGATGCCGCACAAGGCATCA，下劃線處為ddsA上游引物)．打靶片段的下游同源臂為大腸桿菌ispB基因翻譯起始密碼子前面的50 bp序列;上游同源臂為ispB基因翻譯終止密碼子后面的50bp序列．ddsA基因的起始密碼子直接與同源臂相連，保證置換后ddsA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不受影響．ddsA與氯霉素抗性基因(Cmr)之間通過 BamHI酶切位點相連．Cmr基因與ddsA基因連接引物p1為CGCGGATCCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAG(下劃線為BamHI位點);連接引物p2為CGCGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCAG(下劃線為BmaHI位點)．以 Primer star為 PCR聚合酶，以 D1和 p1為引物擴增pKD3上的Cmr基因;以D2和p2為引物擴增質(zhì)粒 pMD18ddsA，條件為:98℃ 1 min;98℃10s，68℃ 70s，30 個循環(huán);68℃ 5min．PCR 產(chǎn)物分別經(jīng)凝膠純化A－T克隆構(gòu)建質(zhì)粒pMD18HC和質(zhì)粒pMD18HD．之后用 BamHI酶切 pMD18HC，并用堿性磷酸酶處理，回收酶切產(chǎn)物;用 BamHI酶切pMD18HD，凝膠回收帶同源臂的 ddsA片段，與pMD18HC用連接酶連接構(gòu)建質(zhì)粒pMD18HCDH．菌落經(jīng)PCR篩選和測序驗證．經(jīng)過克隆構(gòu)建出ispB基因置換打靶片段，其結(jié)構(gòu)見圖1．圖1中，F(xiàn)RT為翻轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點的縮寫．

圖1 置換大腸桿菌ispB基因的打靶片段結(jié)構(gòu)Fig．1 Structure of target fragment for substituting Escherichia coli ispB gene

對驗證無誤的菌落振蕩培養(yǎng)提取質(zhì)粒，用引物D1和D2進行PCR，條件同前，制備打靶片段．后續(xù)操作參照文獻［18］進行．ispB基因置換利用了大腸桿菌的red重組系統(tǒng)．工具質(zhì)粒pKD46在阿拉伯糖的誘導下合成Exo、Beta、Gam 3種蛋白．Exo結(jié)合在通過電轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌的同源臂的末端，自5'向3'降解形成單鏈的同源臂末端．Beta蛋白結(jié)合在形成的同源臂單鏈上，引導目的片段ispB的置換重組．Gam抑制RecBCD活性，防止其對打靶片段的降解．重組后利用打靶片段上的氯霉素抗性標記進行篩選，再用pCP20質(zhì)粒上的翻轉(zhuǎn)酶重組酶(FLP)結(jié)合在Cmr兩端的FRT位點上，通過兩位點自身重組，消除掉Cmr基因．其置換過程見圖2．

圖2 ddsA基因置換大腸桿菌ispB基因的過程Fig．2 Process of substitution of Escherichia coli ispB with ddsA

用菌落PCR篩選陽性克隆，引物為ispB上下游的特異性片段 c1(GACCTTCGCTTACTCGG)和 c2(CCTTCGCAATAATCATCTC);工具酶為 rTaq．反應條件為:94℃ 5min;94℃ 30s，44℃ 30s，72℃ 3min，30個循環(huán);72℃ 5 min．所得2900 bp的片段為陽性克?。?/p>

1．4 大腸桿菌 BL21 ubiA、ispA、idi基因克隆及與ddsA串聯(lián)表達

在CoQ10合成過程中聚十異戊二烯焦磷酸合成酶、對羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、法呢基焦磷酸合成酶、異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶是關鍵酶．將以上4種關鍵酶按上述順序依次克隆至pQE30上，在每基因前加上獨立的SD序列進行串聯(lián)表達，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21R1，誘導表達，促進CoQ10合成．以大腸桿菌BL21基因組為模板，分別設計引物PCR擴增 ubiA、ispA、idi基因，并分別進行 A－T克?。甈CR檢測和測序鑒定．先將 ddsA克隆到pQE30多克隆位點 BamHI和SacI之間構(gòu)建質(zhì)粒pQE30D．并依次將 ubiA、ispA、idi克隆到 pQE30D 多克隆位點的 SacI與 SmaI、SmaI與 PstI、PstI與 HindⅢ之間，每序列前面均帶有核糖體結(jié)合位點(RBS，GAAGGAGATATACC)以方便各基因分別翻譯，相應地構(gòu)建 pQE30DA、pQE30DAF、pQE30DAFI．各載體的結(jié)構(gòu)見圖3．將上述各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入經(jīng)ddsA置換的大腸桿菌宿主菌內(nèi)，分析其對CoQ10合成的促進作用．

圖3 多酶共表達體系的構(gòu)建Fig．3 Construction of enzymes co－expression systems

1．5 CoQ10分析

含質(zhì)粒的菌種，振蕩培養(yǎng)至D(600)=0．6后，添加IPTG至0．2 mmol/L繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h，檢測D(600)，根據(jù)標準曲線換算成細胞干重．取50 mL菌液離心收集菌體，加無菌水清洗一遍，加正已烷3mL，超聲抽提10 min，離心收集上清．重復抽提一遍，合并兩次上清，減壓蒸餾除去溶劑，加入色譜純乙醇1mL，溶解樣品．用島津Prominence LC－20A檢測，采用 shodex C18M 4E(250 mm ×4．6 mm)柱，柱溫為32℃，流動相乙醇/甲醇體積比為7∶3，流速為1mL/min，用紫外檢測器檢測，檢測波長為275nm［19］．

2 實驗結(jié)果與討論

2．1 ddsA基因的鑒定

以提取的放射型根瘤菌基因組為模板，以引物RDup和RDdown進行PCR擴增，得到一條長度為1100bp左右的片段，經(jīng)A－T克隆，獲得 E．coliDH5α轉(zhuǎn)化體，以相同引物對轉(zhuǎn)化體進行鑒定，結(jié)果見圖4．

圖4 ddsA A－T克隆的菌落PCR篩選結(jié)果Fig．4 Screening results of ddsA A－T clone by using colony PCR 1—200bp DNA標準物;2－12—樣品

ddsA 基因全長為1077bp．圖4 中第2、3、5、8、9、10、11泳道均有相應PCR條帶，初步判定為陽性克?。疄檫M一步確定結(jié)果，隨機選擇第3、8、10泳道的陽性克隆送樣測序分析，將結(jié)果在Genebank中進行Blast比對，證明所得片段為放射型根瘤菌ddsA基因．

2．2 ispB基因置換和目標重組體的獲得

引物c1位于ispB上游388 bp處，c2位于ispB下游316bp處，ispB全長942 bp，c1與c2之間相距1675bp．未取代前，以c1與c2為引物的PCR產(chǎn)物長度為1675 bp．以打靶片段取代之后，加上氯霉素基因，再以c1與c2為引物進行PCR，其產(chǎn)物長度變成2902 bp．將氯霉素抗性基因消除后，以c1與c2為引物進行PCR的產(chǎn)物長度為1900 bp左右(包含由于氯霉素抗性基因消除時留下的一個FRT位點)．以c1與c2為引物，分別以替代前、替代后帶Cmr、替代后不帶Cmr的基因組為模板進行PCR，所得結(jié)果見圖5．

圖5 大腸桿菌BL21 ispB基因替代前后的PCR鑒定Fig．5 PCR identification of Escherichia coli BL21 ispB before and after substitution

圖5中ispB基因替代前后的PCR結(jié)果符合預期．為進一步確證，將替代后Cmr消除前的PCR產(chǎn)物送樣測序．其基因序列結(jié)構(gòu)與設計一致，表明ddsA基因置換ispB成功．

2．3 重組大腸桿菌的CoQ10合成

菌落PCR為陽性的克隆，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，用HPLC分析CoQ的種類，結(jié)果見圖6．圖6(a)－(c)示出了標準CoQ10、ispB未置換的大腸桿菌BL21(DE3)中所含的CoQ8、ispB被ddsA置換后大腸桿菌BL21所含的CoQ種類(包括CoQ9和CoQ10)．通過對比圖6(b)和(c)可以證明ispB已被ddsA成功置換，故不再具有CoQ8合成能力．放射型根瘤菌的ddsA在大腸桿菌中，除了可以合成CoQ10外還合成CoQ9，這與文獻［19］的報道一致．筆者已經(jīng)通過實驗驗證，這種合成的非特異性由菌體培養(yǎng)環(huán)境引起(結(jié)果將在另一篇文章刊出)．這一結(jié)果同時證明，在大腸桿菌中，CoQ10完全可以替代 CoQ8的功能，不影響大腸桿菌的正常代謝．但各CoQ6－10種類之間，是否都可以完全相互替代，則還需要進一步證明．

圖6 ispB被ddsA替代前后CoQ的HPLC檢測Fig．6 HPLC detection of CoQ of Escherichia coli before and after substituting ispB with ddsA

2．4 多酶共表達促進CoQ10合成

根據(jù)文獻［19］的報道，在CoQ10的合成體系中ddsA、ubiA、ispA、idi 4 種酶為關鍵酶．其中 ddsA 基因產(chǎn)物為聚十異戊二烯焦磷酸合成酶，催化CoQ10的側(cè)鏈聚十異戊二烯焦磷酸;ubiA基因產(chǎn)物為對羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，負責將聚異戊二烯連接到對羥基苯甲酸苯環(huán)的第3位碳原子上;ispA基因產(chǎn)物為法呢基焦磷酸合成酶，催化合成聚十異戊二烯焦磷酸合成的前體;idi的基因產(chǎn)物為異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶，將異戊二烯焦磷酸異構(gòu)為二甲基烯丙基焦磷酸，后者為異戊二烯焦磷酸聚合的引導物．對于CoQ的合成代謝調(diào)節(jié)機理，目前依然知之甚少．

根據(jù)本實驗室的實驗結(jié)果，pQE30是表達放射型根瘤菌ddsA的良好載體．其它研究者雖然有利用pET32、pET28和pUC18作載體成功表達其它物種ddsA 的例子［20－22］，但在本實驗中，用上述載體表達的酶均為包涵體，不能用于促進CoQ10的合成．這可能與不同來源ddsA的表達產(chǎn)物折疊時的難易不同有關．放射型根瘤菌聚十異戊二烯合成酶(DPS)在折疊時相對困難，因此在用強啟動子表達時，表達速度太快，使產(chǎn)物來不及形成正確的折疊．用啟動能力相對較弱的pQE30時則不存在這個問題，可以形成正確的折疊，故本實驗選用pQE30作載體．

將上述構(gòu)建的各表達體系轉(zhuǎn)入E．coli BL21R1，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽性克隆，接種入50mL LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)檢測其CoQ10合成能力，結(jié)果見表1．

表1 各工程菌CoQ10合成情況Table 1 Results of all recombinants for CoQ10production

從表1中可以看出，隨著表達酶種類的增多，細胞干重呈下降趨勢．這主要是因為，隨表達酶數(shù)量的增加，菌體所承受的負擔增加，使菌體生長速度下降所致．同時，隨表達酶種類的增多，干菌體中CoQ10含量增加，其中帶有 pQE30D、pQE30DA、pQE30DAF、pQE30DAFI的BL21R1相對不帶質(zhì)粒的BL21R1分別提高 38．5%、86．5%、117．3%、126．9%．按構(gòu)建順序進行前后比較，CoQ10提高幅度由高到低分別為pQE30DA(48．0%)、pQE30D(38．5%)、pQE30DAF(30．8%)、pQE30DAFI(9．6%)．ddsA 催化合成的產(chǎn)物為ubiA的底物，在強化ddsA的前提下，強化ubiA比不強化ubiA時的CoQ10的產(chǎn)量提高幅度高，表明在強化ddsA的前提下，ubiA是CoQ10合成的瓶頸．綜合而言，ddsA與ubiA對CoQ10產(chǎn)量影響較大，為關鍵基因;ispA與idi對CoQ10產(chǎn)量影響較小，為次關鍵基因．最終得到的 E．coli BL21R1 pQE30－DAFI的 CoQ10合成能力相對于出發(fā)菌株提高了1．269倍．

3 結(jié)語

通過將大腸桿菌ispB置換為放射型根瘤菌ddsA，使合成CoQ8大腸桿菌可以合成CoQ10，證明CoQ10可代替大腸桿菌中CoQ8的功能．通過強化CoQ10合成過程中的關鍵酶 ddsA、ubiA、ispA、idi等，可以使大腸桿菌CoQ10合成能力由出發(fā)菌株的(0．52±0．03)mg/g(干菌體)，提高至(1．18 ±0．02)mg/g(干菌體)，提高幅度達126．9%．大腸桿菌遺傳背景清晰，代謝簡單，安全性好，生長迅速，被廣泛用于構(gòu)建多種工業(yè)生產(chǎn)菌種，但到目前為止，還未成功構(gòu)建用于生產(chǎn)CoQ10的菌種．可能的原因是對大腸桿菌中與CoQ合成相關的一些機制還未完全了解．因此，為利用大腸桿菌生產(chǎn)CoQ10，需要進一步研究其調(diào)節(jié)機制，才能最終實現(xiàn)突破．

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