路 嬌，羅 薇，劉內(nèi)生，劉 群

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

鴨病毒性肝炎是由鴨甲肝病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）引起雛鴨的一種以肝臟呈現(xiàn)出血性炎癥為特征的急性、高度接觸性和致死性傳染病。該病呈世界性分布，我國(guó)以Ⅰ型鴨病毒性肝炎為主，嚴(yán)重危害了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。目前我國(guó)普遍采用接種鴨肝炎弱毒活疫苗或注射高免卵黃抗體的方式預(yù)防該病，雖有效果，但存在病毒株變異、弱毒株返強(qiáng)、免疫安全等問(wèn)題。因此，開(kāi)拓疫苗研究的新領(lǐng)域是當(dāng)前的熱點(diǎn)問(wèn)題。Ⅰ型鴨甲肝病毒（DHAV-1）是小RNA病毒中的一員，其結(jié)構(gòu)蛋白Vp1位于病毒殼體的表面，具有主要的型特異性抗原中和位點(diǎn)，已被證明具有良好的反應(yīng)原性［1］，但其是否具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，使動(dòng)物獲得保護(hù)的能力還不得而知。本試驗(yàn)以表達(dá)純化的I型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1重組蛋白為抗原，制備Vp1重組蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨，采用間接ELISA方法對(duì)雛鴨的免疫保護(hù)效果進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)動(dòng)物攻毒試驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫保護(hù)效果。

1 材料

1.1 菌毒株 Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1基因原核表達(dá)工程菌（pET32a+Vp1，BL21（DE3）PlysS），由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存［1］；Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)雞胚傳代致弱［2］，TCID50=10-14.62／200 μL；攻毒毒株：西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定的自臨床分離DHAV-1野毒，LD50=2-4／0.2mL。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自四川省廣漢周邊地區(qū)DVH抗體陰性的1日齡非免疫雛鴨，本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至試驗(yàn)適日齡。健康成年家兔，雄性，體重2～3kg，購(gòu)自四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 血清 DHAV-1陽(yáng)性血清（中和效價(jià)1∶320，批號(hào)：011012）、DHAV-1陰性血清，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 方法

2.1 Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1蛋白的原核表達(dá)、純化及濃度測(cè)定 將MY株Vp1基因原核表達(dá)工程菌按文獻(xiàn)［1］的方法進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，PBS緩沖液懸浮，超聲波裂解，離心后收集沉淀和上清，沉淀用適量的PBS重懸。用含1%Triton-100、2mol／L尿素的 PBS反復(fù)洗滌，離心收集沉淀，再用含8mol／L尿素的PBS溶解沉淀，離心收集上清，然后進(jìn)行透析、濃縮，SDS-PAGE電泳觀察。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品中的蛋白濃度。

2.2 兔抗MY株Vp1重組蛋白的多克隆抗體對(duì)細(xì)胞的中和保護(hù)力評(píng)價(jià)

2.2.1 抗MY株Vp1重組蛋白免疫血清的制備按照文獻(xiàn)［3］方法將高純度的MY株Vp1融合蛋白液（2mg／mL）作為抗原，與油佐劑按1∶1的比例配制成Vp1重組蛋白亞單位油乳劑疫苗，無(wú)菌檢驗(yàn)后免疫家兔。將制得的MY株Vp1重組蛋白亞單位疫苗背部皮下6點(diǎn)注射，每只家兔接種1mL（蛋白終濃度為1mg／mL）。免疫3次，每次免疫間隔10d，三免后7d耳緣靜脈采血1mL，分離血清，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血清免疫效價(jià)，采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)。待瓊脂免疫擴(kuò)散法試血的血清效價(jià)≥1∶32時(shí)心臟采血，取血清分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 細(xì)胞中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法） 取少量兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清56℃滅活30min，按 2-1、2-2……2-6進(jìn)行稀釋。再將100TCID50／0.1mL的MY株雞胚化弱毒稀釋液與倍比稀釋的血清1∶1混合，37℃感作1h，向已培養(yǎng)好的雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板加入不同稀釋度的0.2 mL病毒-血清混合液，同時(shí)做細(xì)胞對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清+抗原對(duì)照和被檢血清毒性對(duì)照，置于溫箱吸附2h，繼續(xù)培養(yǎng)觀察，記錄細(xì)胞病變情況，6d后終判。

2.3 MY株Vp1重組蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨后抗體水平監(jiān)測(cè)及攻毒保護(hù)試驗(yàn)

2.3.1 動(dòng)物分組與免疫 將ELISA檢測(cè)結(jié)果為陰性的3日齡非免疫雛鴨200只隨機(jī)分成A、B、C、D、E 5組，每組40只，右腿腿肌注射接種。免疫組A、B、C接種MY株Vp1蛋白亞單位疫苗，接種蛋白含量分別為50μg／只、100μg／只、200μg／只；免疫組D接種DHAV-1雞胚化弱毒MY株，免疫量為～ELD50／只；組E注射生理鹽水作為陰性對(duì)照組，0.2mL／只。

2.3.2 免疫雛鴨后抗體水平監(jiān)測(cè)及攻毒保護(hù)試驗(yàn)免疫后第3、5、7、9、14、21天分別從每組隨機(jī)抽取3只雛鴨采血，用純化重組Vp1蛋白作為包被抗原，間接ELISA法檢測(cè)血清中的Vp1蛋白抗體效價(jià)，監(jiān)測(cè)免疫后各組雛鴨產(chǎn)生抗體的消長(zhǎng)情況；同時(shí)，在各采血時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取5只雛鴨，用4LD50的臨床分離DHAV-1毒進(jìn)行攻毒，觀察記錄每組鴨的死亡及存活情況，攻毒后第7天進(jìn)行終判，統(tǒng)計(jì)各組的保護(hù)率。

3 結(jié)果與分析

3.1 Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1蛋白的原核表達(dá)、純化及濃度的測(cè)定 SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，得到了大小為47kDa的Vp1重組蛋白，依次用含1%Triton-100、2mol／L尿素的PBS洗滌包涵體得到了高純度的重組Vp1蛋白（圖1）。BCA蛋白定量法測(cè)得純化蛋白終濃度為983μg／mL。

圖1 Vp1重組蛋白的表達(dá)及純度的測(cè)定

3.2 兔抗MY株Vp1重組蛋白的多克隆抗體對(duì)細(xì)胞的中和保護(hù)力試驗(yàn) 瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)制備兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清效價(jià)≥64，將免疫血清與MY株雞胚化弱毒在雞胚成纖維細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞中和試驗(yàn)，Reed-Muench法計(jì)算結(jié)果。TCID50=10-1.65=1／45，即1／45為該兔抗 MY株 Vp1重組蛋白高免血清的中和抗體效價(jià)。同時(shí)，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的中和效價(jià)為1／53。結(jié)果表明，制備的兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清能夠?qū)Ρ籑Y株雞胚化弱毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)，具有中和抗體的作用（圖2，3，4）。

圖4 7d血清中和對(duì)照

3.3 MY株Vp1重組蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨后抗體消長(zhǎng)及免疫攻毒試驗(yàn)

3.3.1 間接ELISA方法檢測(cè)不同劑量Vp1重組蛋白免疫后雛鴨血清的抗體效價(jià) ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，各組免疫雛鴨在免疫后的第3天均已產(chǎn)生抗體，在免疫后21d內(nèi)，皆呈上升趨勢(shì)；各免疫組與陰性對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），各免疫組之間抗體水平差異不明顯（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

3.3.2 免疫攻毒試驗(yàn) 用4×LD50的臨床分離DHAV-1病毒進(jìn)行攻毒，免疫組A、B、C（每組n=30只）雛鴨的存活率分別為47%、50%，57%，均高于組E（未免疫組）的20%，免疫組與未免疫組之間差異顯著（P＜0.05），組 A、B、C之間差異不明顯（P＞0.05）。但重組 Vp1各免疫組均低于組 D（MY株弱毒免疫組）的存活率83%。

4 討論

目前對(duì)DHAV的免疫預(yù)防主要依靠弱毒疫苗和滅活疫苗。但近年的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)華南地區(qū)DHAV有不同的基因型和血清型病毒株的出現(xiàn)，而DHAV不同血清型之間不能產(chǎn)生交叉保護(hù)，因此，使弱毒疫苗免疫保護(hù)力有所下降，也是疫苗不能產(chǎn)生交叉保護(hù)的主要原因［4］。由于傳統(tǒng)疫苗存在的固有缺陷，如潛在的毒力返強(qiáng)威脅和免疫鴨疫苗株與野毒株難以區(qū)別等，為DHAV的控制帶來(lái)了困難，因此研制安全有效的DHAV疫苗是亟待解決的問(wèn)題，確定病毒中與免疫相關(guān)的位點(diǎn)則非常重要。

本試驗(yàn)將DHAV-1MY株Vp1重組蛋白為抗原制成的亞單位疫苗免疫家兔，將制備的兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清與MY株雞胚化弱毒進(jìn)行細(xì)胞中和試驗(yàn)，結(jié)果表明，制備的兔抗 MY株Vp1重組蛋白高免血清和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清一樣能夠?qū)Ρ籑Y株雞胚化弱毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)，具有中和抗體的作用。同時(shí)，動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，重組Vp1免疫雛鴨的存活率均高于未免疫組（P＜0.05），但低于組 MY株弱毒免疫組，且差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，重組Vp1蛋白免疫后使雛鴨獲得了一定的免疫保護(hù)。這與裴宗飛［3］報(bào)道的Vp1-C3d-pcDNA3基因疫苗免疫效果的研究結(jié)論相符，單一蛋白抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的保護(hù)力偏低。但也有學(xué)者認(rèn)為Vp1重組蛋白以沒(méi)有活性的包涵體形式表達(dá)，在復(fù)性過(guò)程中形成了一些無(wú)活性的多聚體，不具有蛋白的天然構(gòu)象，從而丟失了一些抗原表位［5］，使最終的免疫效果受到影響；何冉婭等［4］發(fā)現(xiàn)其在2007～2009年華南地區(qū)分離的DHAV毒株的RGD或QSD基序存在變異，變異會(huì)改變病毒粒子與細(xì)胞受體之間的關(guān)系，引起免疫效果降低；近來(lái)也有試驗(yàn)證明，DHAV-1結(jié)構(gòu)蛋白VP3同樣具有免疫原性［6］，提示DHAV-1亞單位疫苗的研制要趨向于多個(gè)抗原組合的應(yīng)用，才能獲得更高的免疫保護(hù)［7-8］；這些還尚需要進(jìn)一步的試驗(yàn)確認(rèn)。

［1］向毅勇，羅薇，靳艷玲，等.鴨肝炎病毒雞胚化弱毒 MY株Vp1基因克隆、原核表達(dá)及抗原性分析［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：68-73.

［2］羅薇，張金靈，劉內(nèi)生，等.Ⅰ型鴨肝炎病毒雞胚致弱毒 MY株的培育及實(shí)驗(yàn)研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（1）：9-14.

［3］裴宗飛.鴨病毒性肝炎C3d新型分子佐劑基因疫苗的研究［D］.山東：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［4］何冉婭，于淼，張玉玲，等.2007～2009年華南地區(qū)鴨肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查及分離株的Vp1基因變異分析［J］.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，18（1）：7-15.

［5］劉利芳.乳膠凝集試驗(yàn)、間接ELISA診斷鴨病毒性肝炎方法的建立［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

［6］劉家森，甘一迪，姜騫，等.鴨肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表達(dá)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，38（7）：587-590.

［7］Bosch H V D，F(xiàn)rey J.Interference of outer membrane protein PalA with protective immunity against Actinobacillu spleurop neumoniae infections in vaccinated pigs［J］.Vaccine，2003，21：3601-3607.

［8］曹素芳，黃青云.禽多殺性巴氏桿菌C48-1成熟外膜蛋白H重組亞單位疫苗免疫效果的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（6）：464-467.