余朝閣 李天來 張亢亢 劉志恒 李琳琳 周 娣

（1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110161；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽 110161；3沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，遼寧沈陽 110161）

茉莉酸（Jasmonic Acid，JA）及其甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）是廣泛存在于植物體中的重要內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)，它不僅參與植物抵抗生物脅迫或非生物脅迫的信號(hào)傳遞過程，也是重要的外源激發(fā)子，可誘導(dǎo)植物對(duì)多種逆境脅迫發(fā)生抗性反應(yīng)（Turner et al.，2002；Thaler et al.，2004）。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物受機(jī)械損傷、病菌侵染或昆蟲取食等逆境脅迫后，JA類物質(zhì)含量大幅升高；外源JA或MeJA則可誘導(dǎo)多種植物抗逆性增強(qiáng)；而茉莉酸缺失或不敏感突變體的抗逆性往往顯著低于其相應(yīng)的野生株（Kazan ＆ Manners，2008；Browse，2009）。

鈣作為植物必需營養(yǎng)元素和重要的胞內(nèi)第二信使，參與植物對(duì)多種逆境抗性信號(hào)傳遞途徑的調(diào)控（Lecourieux et al.，2002；Dodd et al.，2010）。JA可誘導(dǎo)蠶豆葉片細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度〔Ca2+〕cyt的迅速上升，從而誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，而Ca2+螯合劑EGTA和質(zhì)膜Ca2+通道的抑制劑硝苯吡啶（Nifedipine，NIF）則阻斷或減弱誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉效應(yīng)（劉新 等，2005）；另外，JA也誘導(dǎo)擬南芥細(xì)胞的鈣動(dòng)員，這一過程既包括胞外Ca2+的流入，也包括胞內(nèi)鈣庫中Ca2+的釋放（孫清鵬 等，2010）；但也有研究認(rèn)為，JA對(duì)番茄葉肉細(xì)胞中〔Ca2+〕cyt沒有影響（Moyen et al.，1998）。

對(duì)比不同研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣在JA信號(hào)傳遞途徑中的作用還存在爭議，機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)系統(tǒng)探索鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄抗灰霉病和幾種重要防御酶活性的影響，為揭示JA誘導(dǎo)番茄抗病性與Ca2+的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）品種為L402，灰霉菌（Botrytis cinerea）由田間分離所得。供試化學(xué)物質(zhì)MeJA購自Sigma公司，CaCl2、LaCl3和EGTA均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

番茄采用穴盤育苗，三葉期定植于直徑為12 cm的塑料缽中。六葉期將幼苗分為5組，其中4組用3 mmol·L-1的MeJA（先用乙醇助溶，然后溶解于蒸餾水，終濃度MeJA為3 mmol·L-1，乙醇體積比為0.1%）涂抹第3片葉至完全潤濕，對(duì)照組則涂抹0.1%的乙醇；晾干后（約1.5 h），對(duì)照和其中1組MeJA處理噴施蒸餾水至完全潤濕（CK和MeJA），其余3組分別噴施等量的20 mmol·L-1的 CaCl2（MeJA+Ca）、3 mmol·L-1的 LaCl3（MeJA+La）和 5 mmol·L-1的 EGTA（MeJA+EGTA）。5 d后用每毫升含1×106個(gè)灰霉菌孢子的懸液接種各處理植株的第3片葉前5裂葉，接種采用微量注射法（Audenaert et al.，2002）。每處理5株，3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

番茄幼苗接種后第5天調(diào)查發(fā)病程度并計(jì)算病情指數(shù)，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照李洪連和徐敬友（2001）的方法。誘導(dǎo)處理后0、1、2、3、5 d分別取第3片葉，在液氮速凍后于-86 ℃下保存，用于植物防御酶活性測(cè)定。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的提取和活性測(cè)定參照余朝閣（2007）的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片抗灰霉病的影響

MeJA顯著提高番茄抗灰霉病程度，MeJA單獨(dú)處理后，番茄葉片病情指數(shù)比對(duì)照低32.1%。外源鈣離子進(jìn)一步增強(qiáng)MeJA誘導(dǎo)的抗病性，MeJA與CaCl2共同處理（MeJA+Ca）的病情指數(shù)比MeJA單獨(dú)處理的病情指數(shù)降低15.1%，達(dá)到顯著水平。而MeJA的誘導(dǎo)抗病性作用可被質(zhì)膜鈣通道抑制劑LaCl3和Ca2+螯合劑EGTA完全抑制，MeJA+EGTA和MeJA+La處理的病情指數(shù)與對(duì)照均無顯著差異，但EGTA的抑制作用顯著強(qiáng)于 LaCl3（圖 1）。上述結(jié)果表明，MeJA可誘導(dǎo)番茄抗灰霉病，外源鈣離子增強(qiáng)MeJA誘導(dǎo)的抗病性，缺鈣處理則抑制MeJA誘導(dǎo)的抗病性，鈣可能參與MeJA誘導(dǎo)番茄抗灰霉病的調(diào)控過程。

圖2 鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中PAL活性的影響

圖3 鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中PPO活性的影響

2.2 鈣對(duì) MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中防御酶活性的影響

2.2.1 PAL活性 各處理番茄葉片中 PAL活性在處理后第1天升高，并均高于對(duì)照。其中，MeJA單獨(dú)處理的PAL活性第2天迅速上升并達(dá)到高峰，然后緩慢下降，但均顯著高于對(duì)照。MeJA+Ca處理的PAL活性也在第2天迅速上升，且第2～5天始終保持較高水平，并顯著高于MeJA單獨(dú)處理。MeJA+EGTA處理的PAL活性在第1天升高后，第1～3天無顯著變化，至第5天則降至與對(duì)照相當(dāng)?shù)乃剑籑eJA+La處理的PAL活性變化趨勢(shì)和MeJA單獨(dú)處理類似，但第2～5天PAL活性略低于MeJA單獨(dú)處理（圖 2）。上述結(jié)果說明，外源鈣離子促進(jìn)MeJA對(duì)番茄 PAL活性的誘導(dǎo)，而 EGTA和LaCl3則抑制 MeJA誘導(dǎo)番茄 PAL活性，且EGTA的抑制作用強(qiáng)于LaCl3。

2.2.2 PPO活性 各處理番茄葉片中 PPO活性在處理后第1天均無顯著變化。其中，MeJA單獨(dú)處理后，PPO活性第2天迅速升高并達(dá)到高峰，然后緩慢下降，到第5天降至對(duì)照水平。MeJA+Ca處理的PPO活性與MeJA單獨(dú)處理的變化趨勢(shì)類似，但在第 2～5天始終顯著高于MeJA單獨(dú)處理。MeJA+EGTA處理的番茄葉片中 PPO活性從第 2天開始略低于對(duì)照，之后繼續(xù)下降，第5天時(shí)顯著低于對(duì)照；MeJA+La處理后3 d內(nèi)，PPO活性與對(duì)照無顯著差異，第5天顯著低于對(duì)照（圖3）。說明外源鈣離子促進(jìn)MeJA對(duì)番茄PPO活性的誘導(dǎo)，而EGTA和LaCl3則抑制MeJA對(duì)番茄PPO活性的誘導(dǎo)作用，且EGTA的抑制程度強(qiáng)于LaCl3。

2.2.3 POD活性 各處理番茄葉片中 POD活性在處理后第1天均無顯著變化，第2天迅速升高，第3天繼續(xù)升高，且在第2～3天內(nèi)均顯著高于對(duì)照。其中，MeJA+Ca和MeJA單獨(dú)處理的 POD活性變化趨勢(shì)整體上一致，處理后第5天仍然繼續(xù)快速升高；但是，在第2～5天內(nèi)，MeJA+Ca處理的 POD活性均顯著高于 MeJA單獨(dú)處理。MeJA+La處理的POD活性第5天也繼續(xù)升高，但顯著低于MeJA單獨(dú)處理；MeJA+EGTA處理第3～5天無顯著變化，且第5天和對(duì)照無顯著差異（圖4）。上述結(jié)果說明，外源鈣離子也促進(jìn) MeJA對(duì)番茄 POD活性的誘導(dǎo)作用，而缺鈣處理對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄POD活性具有一定的抑制作用。

2.2.4 CAT活性 MeJA單獨(dú)處理后3 d內(nèi)，CAT活性與對(duì)照無顯著差異，第 5天有所升高，并顯著高于對(duì)照。MeJA+Ca處理后1～5 d內(nèi)，CAT活性始終保持緩慢上升，至第5天顯著高于對(duì)照和其他各處理。MeJA+EGTA和MeJA+La兩個(gè)處理的CAT活性均在第1天迅速升高；MeJA+EGTA處理的CAT活性在第2天和第1天之間無顯著變化，第2～5天緩慢下降；而MeJA+La處理的CAT活性在第2天迅速下降至對(duì)照水平以下，第2～5天緩慢上升至對(duì)照水平（圖 5）。整體看來，外源鈣離子對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄CAT活性的影響無明顯的規(guī)律性。

2.2.5 SOD活性 各處理 SOD活性均呈先升高、后降低、再升高的趨勢(shì)。但 MeJA+Ca和MeJA+EGTA處理第1～3天緩慢下降至對(duì)照水平以下，第3～5天升高至對(duì)照水平以上。而MeJA+La和 MeJA單獨(dú)處理第 1～2天迅速下降至對(duì)照水平以下，第2～5天緩慢升高至對(duì)照水平（圖6）。上述結(jié)果顯示，外源鈣離子對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄SOD活性的作用也不確定。

圖4 鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中POD活性的影響

圖5 鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中CAT活性的影響

圖6 鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中SOD活性的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源MeJA可誘導(dǎo)番茄抗灰霉病能力增強(qiáng)，也誘導(dǎo)番茄葉片中PAL、PPO和POD等防御酶活性提高。外源鈣離子進(jìn)一步增強(qiáng)MeJA誘導(dǎo)的抗病性及上述防御酶活性；鈣螯合劑EGTA或質(zhì)膜鈣通道抑制劑LaCl3均抑制MeJA誘導(dǎo)番茄的抗病性和上述防御酶活性。而鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中CAT和SOD活性的影響未發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。所以認(rèn)為，鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄抗灰霉病的調(diào)控可能主要與其對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中PAL、PPO和POD活性的影響有關(guān)。

盡管鈣和茉莉酸類物質(zhì)在植物抵抗逆境脅迫中的作用已有大量系統(tǒng)深入研究，也有部分研究發(fā)現(xiàn) Ca2+參與JA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；但是，對(duì)Ca2+和JA在植物抗逆性中的相互關(guān)系的研究并不多見，特別是鈣對(duì)JA類物質(zhì)誘導(dǎo)的植物抗病性和誘導(dǎo)植物防御酶反應(yīng)的影響研究，更是鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)探明了外源鈣離子在 MeJA誘導(dǎo)番茄抗灰霉病中的作用，并系統(tǒng)探索了鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄5種重要防御酶活性的影響，初步明確外源鈣離子增強(qiáng)MeJA誘導(dǎo)番茄抗灰霉病程度，與其對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄PAL、PPO和POD3種主要防御酶活性的調(diào)控有關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果將為揭示鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄抗病性的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

PAL、PPO和POD是催化植物體中酚類物質(zhì)和木質(zhì)素形成的關(guān)鍵酶，而酚類物質(zhì)和木質(zhì)素則是植物體中重要的抗病物質(zhì)；鈣參與調(diào)節(jié) MeJA誘導(dǎo)上述防御酶活性，推測(cè)鈣也可能進(jìn)一步影響MeJA誘導(dǎo)番茄酚類物質(zhì)和木質(zhì)素等抗病物質(zhì)的積累。這也將是進(jìn)一步研究的重要內(nèi)容。

鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄葉片中CAT和SOD活性未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性影響。CAT和SOD是重要的抗氧化酶，可以清除植物體內(nèi)活性氧；而活性氧一方面可以激活植物防御系統(tǒng)，另一方面，其大量積累也將對(duì)植物自身產(chǎn)生傷害作用。鈣對(duì)MeJA誘導(dǎo)番茄CAT和SOD活性影響的不確定性，可能與植物體中活性氧作用的兩面性和復(fù)雜性有關(guān)。

李洪連，徐敬友．2001．農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：150．

劉新，石武良，張蜀秋，婁成后．2005．Ca2+參與茉莉酸誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)．實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，38（4）：297-301．

孫清鵬，于涌鯤，萬善霞，趙福寬，郝玉蘭．2010．胞外及胞內(nèi)Ca2+共同參與擬南芥中茉莉酸誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（5）：942-948．余朝閣．2007．鈣對(duì)化學(xué)誘抗劑誘導(dǎo)番茄抗灰霉病及其相關(guān)防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)控作用〔博士論文〕．沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)：36-38．

Audenaert K，De Meyer G B，Hofte M M．2002．Abscisic acid determines basal susceptibility of tomato toBotrytis cinereaand suppresses salicylic acid-dependent signaling mechanisms．Plant Physiology，128（2）：491-501．

Browse J．2009．Jasmonate passes muster：a receptor and targets for the defense hormone．Annu Rev Plant Biol，60：183-205．

Dodd A N，Kudla J，Sanders D．2010．The language of calcium signaling．Annu Rev Plant Biol，61：593-620．

Lecourieux D，Mazars C，Pauly N，Ranjeva R，Pugin A．2002．Analysis and effects of cytosolic free calcium increases in response to elicitors inNicotiana plumbaginifoliacells．The Plant Cell，14：2627-2641．

Moyen C，Hammond-Kosack K E，Jones J，Knight M R，Johannes E．1998．Systemin triggers an increase of cytoplasmic calcium in tomato mesophyll cells：Ca2+mobilization from intra-and extracellular compartments．Plant，Cell & Environmet，21：1101-1111．

Kazan K，Manners J M．2008．Jasmonate signaling：toward an integrated view．Plant Physiology，146：1459-1468．

Thaler J S，Owen B，Higgins V J．2004．The role of the jasmonate response in plant susceptibility to diverse pathogens with a range of lifestyles．Plant Physiol，135：530-538．

Turner J G，Ellis C，Devoto A．2002．The jasmonate signal pathway．The Plant Cell，Supplement：153-164．