萬志兵 王小龍 管宏偉 仰皖旭 尹佟明 張新葉

(江蘇省楊樹品種改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京林業(yè)大學(xué))，南京，210037) (湖北林業(yè)科學(xué)研究院)

楊樹(Populus)是我國(guó)適生范圍較廣的樹種之一，是重要的速生豐產(chǎn)工業(yè)用材、四旁綠化、農(nóng)田林網(wǎng)和防風(fēng)固沙樹種。隨著我國(guó)木材用量的不斷增加，楊樹大面積推廣，全國(guó)楊樹人工林的栽培面積超過700萬hm2，其中大部分為單一品種構(gòu)成的純林。雖然大面積純林可為工業(yè)利用提供品質(zhì)較為均一的原材料，但在營(yíng)林方面暴露出一些弱點(diǎn)，特別是容易導(dǎo)致病蟲害的暴發(fā)流行，造成嚴(yán)重減產(chǎn)。楊樹銹病是楊樹生產(chǎn)中的一種主要病害［1］。夏秋季節(jié)，葉片出現(xiàn)大量黃色銹粉物(夏孢子)，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)會(huì)布滿整個(gè)葉片和林帶，導(dǎo)致提早落葉，嚴(yán)重影響樹木光合和生長(zhǎng)。防治該病經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)境安全的方法是利用抗病品種。然而，由于楊樹銹菌具有高度的變異性和種植抗病品種造成的選擇壓力，楊樹銹菌種群變異很快，毒力結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜［2］。楊樹銹菌致病變異性一般是通過接種不同楊樹品種進(jìn)行毒力檢測(cè)來評(píng)價(jià)［3］。用致病性作為病原菌遺傳變異的指標(biāo)存在一些缺點(diǎn)，如費(fèi)工費(fèi)時(shí)、需要很大的溫室空間、受溫濕度及接種技術(shù)等的影響大，而且由于抗病性和感病性的分類受主觀性因素影響，表型變異往往不穩(wěn)定。因此，需要利用更加有效的手段來進(jìn)行楊樹銹菌的鑒定和研究楊樹銹菌的變異情況。

分子標(biāo)記技術(shù)已成為植物病原真菌遺傳變異研究和檢測(cè)的重要手段。一些基于DNA的分子標(biāo)記，如rDNA－ITS，RFLP，RAPD等技術(shù)也已應(yīng)用于楊樹銹菌的鑒定、遺傳變異及多樣性、無毒基因作圖等研究［4－8］。與RFLP及RAPD等分子標(biāo)記相比，SSR是一種更加有效的標(biāo)記技術(shù)。SSR標(biāo)記雖然在一些植物和動(dòng)物中已被廣泛開發(fā)和應(yīng)用，但在真菌中卻開發(fā)得很少［9－12］。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSRs)或微衛(wèi)星(microsatellites)是以1～6個(gè)堿基為基元的串聯(lián)重復(fù)序列，它們普遍存在和隨機(jī)分布于大多數(shù)真核生物的基因組中，重復(fù)數(shù)具有高頻率的變異，這種?；稽c(diǎn)的多態(tài)性可以十分容易地通過設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)［13］。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、多等位性、共顯性、容易用PCR檢測(cè)、重復(fù)性高等特點(diǎn)，是一種理想的分子標(biāo)記，但開發(fā)SSR標(biāo)記需要事先知道基因組序列信息，對(duì)沒有基因組序列的物種而言，開發(fā)SSR標(biāo)記是昂貴和低效的［13－14］。隨著表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)技術(shù)的發(fā)展，EST數(shù)據(jù)庫為開發(fā)SSR標(biāo)記提供了快速、有效和廉價(jià)的途徑［15］。EST是通過對(duì)cDNA文庫中隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長(zhǎng)度一般為150～500 bp。近年來隨著功能基因組的研究，大量的EST數(shù)據(jù)收錄于NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心)，為EST－SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了豐富的序列資源。由于EST－SSR標(biāo)記開發(fā)是基于基因組中的表達(dá)序列，因此標(biāo)記要近緣物種間有很高的通用性［16－19］，再加上現(xiàn)在高度發(fā)展的信息技術(shù)為從EST序列中開發(fā)SSR標(biāo)記提供了豐富的軟件［20］，這一切都使得EST－SSR標(biāo)記成為當(dāng)今熱門的分子標(biāo)記技術(shù)。一些植物如葡萄、小麥的EST－SSR標(biāo)記已開發(fā)利用［21－24］。在植物病原真菌中，Kaye 等人［9］也開發(fā)了少量水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的EST－SSR標(biāo)記，朱振東等［25］報(bào)道了從大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann＆Gerdemann)的EST序列中開發(fā)的EST－SSR標(biāo)記。

迄今，在GenBank中已有6萬多條楊樹銹菌EST序列。本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫中楊樹銹菌的EST序列，對(duì)這些序列進(jìn)行了拼接和組裝，在此基出上，開展了這些序列所含微衛(wèi)星的查找，并對(duì)楊樹銹菌基因組中基因轉(zhuǎn)錄序列所含微衛(wèi)星重復(fù)序列的特征和組成情況進(jìn)行了分析，然后根據(jù)所發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)SSR引物，并隨機(jī)選取了部分引物對(duì)進(jìn)行了試驗(yàn)分析，以期為楊樹銹菌的研究提供有價(jià)值的遺傳工具和分子標(biāo)記資源。

1 材料與方法

1.1 楊樹銹菌EST-SSR序列的檢索

從GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)以 FASAT 格式下載楊樹銹菌EST序列。序列拼接的計(jì)算機(jī)為Power Edge T710(內(nèi)存60G)，使用的軟件為GS De nove Assembler，拼接參數(shù)采用默認(rèn)值。采用C語言編輯的 Sputnik(C.Abajian，University of Washington)程序進(jìn)行所有重復(fù)單元長(zhǎng)度為2～5個(gè)堿基的微衛(wèi)星的查找，程序默認(rèn)閾值最小Score設(shè)定為9。

不同重復(fù)單元微衛(wèi)星密度的計(jì)算:D=N/L。D為不同重復(fù)單元微衛(wèi)星密度;N為各重復(fù)單元微衛(wèi)星數(shù)量;L為楊樹銹菌EST序列拼接片段總長(zhǎng)。

將所有回紋重復(fù)序列及其互補(bǔ)的序列歸為一類，如 AAG 基序代表所有 AAG、AGA、GAA、CTT、TCT和TTC的SSR。據(jù)此，2核甘酸重復(fù)序列歸為4類，3核甘酸重復(fù)序列歸為10類，4核甘酸重復(fù)序列歸為33類，5核甘酸重復(fù)序列歸為102類。

1.2 EST-SSR 引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0和Oligo6.0設(shè)計(jì)楊樹銹菌EST－SSR引物。Primer Premier 5.0主要用于引物的自動(dòng)檢索，其基本檢索條件為:EST序列長(zhǎng)度大于100 bp;EST－SSR序列的開始和結(jié)束分別距5’和3’端不少于20 bp;引物長(zhǎng)度18～24 bp;GC含量40% ～60%;理論退火溫度(Tm)40～60℃;預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在100～500 bp;盡量避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)dimer、hairpin、falseprimer以及連續(xù)6個(gè)堿基配對(duì)的出現(xiàn)。Oligo 6.0主要用于對(duì)檢索到的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)分析:正反引物的Tm值相差不能超過5℃，5’端Tm稍微高于3’端Tm。設(shè)計(jì)的引物上傳至網(wǎng)址 ftp://202.119.210.12，讀者可與作者聯(lián)系下載引物數(shù)據(jù)庫。我們從表中隨機(jī)挑選了30對(duì)引物(數(shù)據(jù)庫中紅色標(biāo)記部分)用于引物的試驗(yàn)驗(yàn)證，這些引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 楊樹銹菌DNA提取與EST-SSR引物驗(yàn)證

以南京林業(yè)大學(xué)樹木園采集的楊樹銹菌為材料，利用北京天恩澤基因科技有限公司玻璃珠法柱式真菌DNAout提取銹菌總DNA。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系采用10 μL反應(yīng)體系，其中含有 1×buffer，Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.4 μmol/L，Taq 酶1.0 U，模板DNA 50 ng。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性85 s，94℃變性35 s，引物退火溫度60 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，120 V電壓電泳40 min后，用Gel Image System Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)成像。有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法顯色檢測(cè)DNA條帶的多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星豐度及分布密度分析

在楊樹銹菌的64498條EST中，經(jīng)過拼接得到1998個(gè)拼接片段，進(jìn)行2～5個(gè)核苷酸重復(fù)的SSR位點(diǎn)搜索發(fā)現(xiàn)604個(gè)SSR位點(diǎn)，拼接片段含有SSR位點(diǎn)的頻率為30.23%，總共有420個(gè)拼接片段含有SSR位點(diǎn)，平均1個(gè)片段含有1.44個(gè)SSR位點(diǎn)，1個(gè)片段含有的SSR位點(diǎn)數(shù)最多的是6個(gè)，69.05%的拼接片段只含有1個(gè)SSR位點(diǎn)，見表1。拼接片段的總長(zhǎng)度是444 907 bp，平均736.6 bp含有1個(gè)SSR位點(diǎn)。

表1 拼接片段中含有SSR位點(diǎn)數(shù)

本研究查找的EST序列中所含微衛(wèi)星為二核苷酸至五核苷酸重復(fù)，其中三核苷酸重復(fù)的數(shù)量最多，占全部SSR的44.70%，為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序。二核苷酸、四核苷酸、五核苷酸所含微衛(wèi)星所占比例分別為 17.05%、17.72%、20.53%。不同重復(fù)單元微衛(wèi)星由于數(shù)量差異較大，所以分布密度的變化也很大，見表2。

表2 不同長(zhǎng)度重復(fù)單元微衛(wèi)星所占百分比及分布密度

2.2 微衛(wèi)星優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元堿基組成

在二堿基重復(fù)類型中，AG基序重復(fù)的數(shù)量最多，共41 個(gè)，占39.8%;其次是 AC，33 個(gè)，占32.0%;AT基序重復(fù)的數(shù)量也達(dá)28個(gè)，占27.2%;而CG基序只有一個(gè)。在10種三堿基重復(fù)類型中，AGT基序數(shù)量最多，共69個(gè)，占25.6%;其次為AAG(22.6%)和ACT(14.4%)，其他重復(fù)基序則相對(duì)較少。四堿基重復(fù)類型共20種，AAAG基序數(shù)量最大，共19個(gè)占17.76%;AATC(14.95%)、AAAC(14.02%)次之;這3種類型基序占了四堿基重復(fù)類型總量的46.73%。24種五堿基重復(fù)類型中AAAAC基序數(shù)量最大，共21 個(gè)占16.9%;其次為AAAAG(12.9%)，見表3。從以上分析可以看出，在楊樹銹菌的EST中，檢測(cè)到的四和五堿基重復(fù)的SSR的種類都不多，可能是在不同物種中，SSR出現(xiàn)的種類存在偏好。

表3 不同長(zhǎng)度重復(fù)單元微衛(wèi)星中各重復(fù)單元含量比例

總體而言，在楊樹銹菌EST中最豐富的微衛(wèi)星類型是三堿基重復(fù)微衛(wèi)星，其次為四堿基重復(fù)微衛(wèi)星，最主要的優(yōu)勢(shì)重復(fù)序列分別是AGT、AAG以及AG類。而在四堿基、五堿基重復(fù)類型中，(AAAN)n和(AAAAN)n分別比同類型其他組合的基序數(shù)量大。這些處于優(yōu)勢(shì)數(shù)目的重復(fù)拷貝類型富含A和T堿基。

2.3 微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布及變異分析

本研究中楊樹銹菌EST序列中微衛(wèi)星的平均長(zhǎng)度為26.07 bp，最長(zhǎng)的為58 bp，最短11 bp。長(zhǎng)度大于20 bp的微衛(wèi)星僅占總數(shù)的15.07%(表4)。

表4 楊樹銹菌微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布及不同長(zhǎng)度微衛(wèi)星頻率

基序重復(fù)次數(shù)的變異引起位點(diǎn)長(zhǎng)度的變化是產(chǎn)生EST－SSR位點(diǎn)多態(tài)性的主要原因。進(jìn)一步對(duì)不同長(zhǎng)度重復(fù)單元的楊樹銹菌微衛(wèi)星的長(zhǎng)度變異情況進(jìn)行了分析(表5)，從扇形部分?jǐn)?shù)量的變化可以看出，三堿基重復(fù)微衛(wèi)星重復(fù)單元的變化次數(shù)顯著高于其他重復(fù)類型微衛(wèi)星的重復(fù)單元變化次數(shù)。長(zhǎng)度變異程度最高的為三堿基重復(fù)微衛(wèi)星，變異程度最低的為五堿基重復(fù)微衛(wèi)星。

表5 不同長(zhǎng)度重復(fù)單元微衛(wèi)星變異情況

2.4 楊樹銹菌EST-SSR引物設(shè)計(jì)及篩選

根據(jù)SSR位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)了455對(duì)SSR引物，隨機(jī)抽取了30對(duì)SSR引物，對(duì)楊樹銹菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，除3對(duì)引物未產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物外，其余27對(duì)引物(90.0%)均擴(kuò)增出SSR特征條帶(圖1)。

圖1 部分引物對(duì)楊樹銹菌基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物

在27個(gè)功能性引物對(duì)中，有19個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增出1條產(chǎn)物帶，其中有13個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物在預(yù)期片段大小范圍之內(nèi)，6個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物大于預(yù)期片段大小;有8個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增出2條或2條以上條帶，都存在擴(kuò)增出在預(yù)期片段大小范圍之內(nèi)的的條帶。共有21個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增出在預(yù)期片段大小范圍之內(nèi)的的條帶，占功能性引物對(duì)的77.8%。

3 結(jié)論與討論

對(duì)64 498條楊樹銹菌EST進(jìn)行篩選組裝，拼接成1 998個(gè)片段，共發(fā)掘了604個(gè)SSR位點(diǎn)，篩選組裝的楊樹銹菌片段序列平均每736.6 bp含有1個(gè)SSR。采用同樣的參數(shù)和分析方法，其他真菌中，香菇的EST序列平均每25.924 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)［26］，大豆疫霉菌的EST序列平均每8.9 kb含有1個(gè)SSR［25］，表明楊樹銹菌含有SSR的頻率很高，SSR十分豐富。由于微衛(wèi)星序列是生物基因組中變異最為迅速的一類序列，楊樹銹菌表達(dá)序列中微衛(wèi)星含量很高，將導(dǎo)致楊樹銹菌基因有很高的變異頻率，我們推測(cè)微衛(wèi)星序列是楊樹銹菌基因變異迅速的重要驅(qū)動(dòng)力。在鑒定的楊樹銹菌EST－SSR中以三核苷酸重復(fù)基元最豐富，占鑒定總數(shù)的50.1%。本研究的結(jié)果與以前報(bào)道的在一些植物中的研究結(jié)果一致［23，27－28］。在基因編碼區(qū)主要存在三核苷酸重復(fù)類型可能是三核苷酸重復(fù)數(shù)的變異不會(huì)引起移碼突變，從而減少突變的壓力。Gao等人［23］發(fā)現(xiàn)許多三核苷酸與具有重要功能的基因相關(guān)，如CCG重復(fù)涉及許多基因的功能，如脅迫抗性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)等。

Rota L R等人［29］曾提出若EST－SSR數(shù)目足夠大和無偏倚性，則4種不同的堿基隨機(jī)組合將產(chǎn)生4種二核苷酸、10種三核苷酸、33種四核苷酸和102種五核苷酸基本重復(fù)基元類型。楊樹銹菌ESTSSR分析的結(jié)果表明，楊樹銹菌不同重復(fù)基元出現(xiàn)的類型表現(xiàn)出很大的偏倚性。二核苷酸中GC重復(fù)單元只出現(xiàn)一次，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他重復(fù)單元。在桃樹［30］、擬南芥［31］、大豆［23］等植物的研究中也表明存在很大的偏倚性，沒有出現(xiàn)GC重復(fù)基元。

按照Temnykh［32］的劃分，按照長(zhǎng)度將微衛(wèi)星分為兩大類:長(zhǎng)度大于等于20 bp的SSR和長(zhǎng)度大于12 bp但小于20 bp的SSR。與第二類SSR相比，第一類SSR序列長(zhǎng)度更長(zhǎng)，具有更高的突變率，因而更不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)604個(gè)微衛(wèi)星長(zhǎng)度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，楊樹銹菌EST序列所含微衛(wèi)星在長(zhǎng)度上存在極顯著的變異，微衛(wèi)星長(zhǎng)度從11～58 bp不等，微衛(wèi)星平均長(zhǎng)度為26.07 bp。微衛(wèi)星主要為長(zhǎng)度較短的重復(fù)序列，長(zhǎng)度大于20 bp的序列僅占微衛(wèi)星總數(shù)的15.07%。在簡(jiǎn)單重復(fù)序列中，序列越長(zhǎng)變異就越大，其多態(tài)性就可能越豐富，就越有利于EST－SSR標(biāo)記的開發(fā)［33－34］。在楊樹銹菌 EST－SSR 位點(diǎn)中重復(fù)最長(zhǎng)的是五核苷酸中長(zhǎng)度為58的一段SSR。EST－SSR的多態(tài)性主要是由于重復(fù)長(zhǎng)度和重復(fù)次數(shù)造成的［35］。SSR一般認(rèn)為是由于DNA復(fù)制過程中聚合酶瞬時(shí)脫離、堿基錯(cuò)配引起的，楊樹銹菌EST序列中SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)為1～111，最大的重復(fù)次數(shù)出現(xiàn)在三核苷酸中。詹少華等［36］首次統(tǒng)計(jì)了SSR基元重復(fù)次數(shù)變異范圍，推測(cè)SSR基元重復(fù)次數(shù)變異范圍越大，分子標(biāo)記的多態(tài)性越高，而且也認(rèn)為SSR重復(fù)基元重復(fù)次數(shù)變異的發(fā)生也與SSR形成有關(guān)。研究楊樹銹菌EST－SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)對(duì)于楊樹銹菌EST－SSR引物擴(kuò)增多態(tài)性分析有重要的意義。

隨著植物病原菌基因組研究的發(fā)展，多種不同類型植物病原菌的EST已被開發(fā)。從EST數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘SSR標(biāo)記，為植物病原菌SSR標(biāo)記的發(fā)展提供了一種便利的途徑。SSR一般都有2～5個(gè)等位位點(diǎn)，在植物病原菌研究中不但可以用于種群遺傳多樣性、近緣種的比較及系譜研究［37－38］，而且還可用于不同寄主的分離物之間的比較［39－40］，或是菌株、小種之間的比較［37－38，41］。本研究從楊樹銹菌EST中發(fā)掘SSR標(biāo)記，證明了這種途徑的有效性和高效性。雖然EST－SSR標(biāo)記與其他一些從非編碼區(qū)分離的標(biāo)記相比在種內(nèi)檢測(cè)的多態(tài)性水平要低，但他們檢測(cè)的是基因組表達(dá)部分的變異，是真正與性狀連鎖的標(biāo)記，這將可能對(duì)決定重要表型性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定。另外，EST－SSR標(biāo)記具有很高的通用性，一旦開發(fā)，可以在近緣種(屬)中應(yīng)用。因此，楊樹銹菌EST－SSR標(biāo)記的開發(fā)利用，為楊樹銹菌及近緣種屬的鑒別、遺傳變異等研究提供了重要的標(biāo)記資源。楊樹銹菌EST－SSR的開發(fā)也將會(huì)促進(jìn)楊樹抗銹病育種的研究。

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