陳國梁，賀曉龍，陳宗禮，任桂梅，梁倩男

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，716000）

提取純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行基因克隆以及其功能分析的一個重要環(huán)節(jié)，也是進(jìn)行分子生物學(xué)研究首先要解決的問題。目前，雖已建立了多種從各種動、植物組織中提取高質(zhì)量總RNA的方法[1～3]，以食用菌為材料提取總RNA的方法亦有報道[4～9]，但關(guān)于冬蟲夏草總RNA的提取方法卻未見報道?；诖?，作者以冬蟲夏草子實(shí)體為材料，用4種方法對其總RNA進(jìn)行提取，以便從中找出一種較適合冬蟲夏草子實(shí)體總RNA提取的方法，為其分子生物學(xué)及基因工程育種研究的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮冬蟲夏草子實(shí)體由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

①RNA的提取 稱取一定量的新鮮冬蟲夏草子實(shí)體，分別采用SDS抽提法、TRIzol法、CTAB-Li-Cl法與DEPC水法進(jìn)行總RNA的抽提。

②RNA質(zhì)量的檢驗(yàn) a.RNA的純度檢驗(yàn)。RNA的純度檢驗(yàn)用核酸蛋白檢測儀進(jìn)行檢測[10]。

b.RNA的完整性。根據(jù)所測的濃度，取相同含量的RNA在穩(wěn)壓7.5 V/cm下進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，EB染色5～10 min，在凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA樣品的純度分析

將所提取的總RNA經(jīng)紫外檢測其230 nm、260 nm、280 nm處的 OD值并計(jì)算 OD260/OD230與OD260/OD280。從表1中可以看出，4種方法提取的總RNA 的 OD260/OD280值均在 1.900～2.303，OD260/OD230的值均在1.845～1.965，表明4種方法提取的總RNA純度均較高，能有效地去除多糖等雜質(zhì)，但仍有蛋白及鹽分的殘留，同時，可能有部分RNA發(fā)生降解導(dǎo)致OD260/OD280的值偏離2.0，這也與電泳結(jié)果（圖1）相吻合。從整體數(shù)據(jù)分析可得出，DEPC水法和SDS法提取的冬蟲夏草子實(shí)體總RNA純度高于CTAB-LiCl法和TRIzol法提取的。

2.2 RNA的完整性分析

表1 4種方法抽提的總RNA純度及產(chǎn)量的比較

4種方法提取的總RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳（圖1）均出現(xiàn)整齊、較清楚的28S與18S條帶。其中DEPC水法提取的總RNA電泳結(jié)果顯 示 ，28S、18S 與5S帶型整齊，無拖尾，且28S帶的亮度約為18S帶的2倍，5S帶很弱，點(diǎn)樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染，可以看出DEPC水法提取得到的總RNA純度高、降解少、完整性好、得率高；SDS法提取的總RNA電泳結(jié)果出現(xiàn)了28S、18S兩條完整性好且清晰的條帶，但亮度較DEPC水法的暗，表明SDS法提取的 RNA量較DEPC水法低；TRIzol法、CTAB-LiCl法提取得到的總RNA電泳結(jié)果顯示28S、18S兩條條帶較為模糊，表明RNA有不同程度地降解。4種方法的5S帶很弱或沒有則表明所使用的樣品比較新鮮，而且裂解液比例適當(dāng)，成分也很適合該樣品的提取。

圖1 4種方法抽提的總RNA電泳

3 小結(jié)與討論

①本試驗(yàn)所采用的4種方法均需研磨、抽提、沉淀、洗滌4個步驟。4種方法除研磨和洗滌2個步驟完全相同外，其在抽提過程所用試劑、抽提次數(shù)及沉淀過程中所用試劑和沉淀次數(shù)均有所不同，所耗費(fèi)時間也不同，見表2。結(jié)合紫外及電泳檢測結(jié)果可得出，4種提取方法中DEPC水法提取的總RNA質(zhì)量最好，SDS抽提法次之，CTAB-LiCl法和TRIzol法效果最差。DEPC水法所用的全部試劑均為常規(guī)試劑，這使得試驗(yàn)成本大大降低，而且整個提取過程操作非常簡單、易行，耗時較短，不需要特別的儀器設(shè)備，所得RNA完整且純度較高，可滿足分子水平試驗(yàn)的要求，是一種較簡單、高效、經(jīng)濟(jì)的適合食用菌總RNA提取的好方法。

②與動、植物組織相比，冬蟲夏草的組成成分和結(jié)構(gòu)與其有一定的差異，尤其是其高含量的多糖以及糖蛋白會形成難溶的膠狀物等，嚴(yán)重影響RNA的提取效率和純度，進(jìn)一步影響到后續(xù)試驗(yàn)操作。本試驗(yàn)針對冬蟲夏草子實(shí)體富含多糖的特點(diǎn)，在4種提取方法上，進(jìn)行了簡單的優(yōu)化，即在抽提的過程中加入1/3體積的5 mol/L（pH=4.8）醋酸鉀溶液以沉淀多糖，結(jié)果表明醋酸鉀能夠較好地除去多糖的污染。

表2 4種提取冬蟲夏草總RNA方法的比較

[1]王學(xué)仁，張改娜，何濤，等.一種快速有效提取植物和真菌DNA和RNA的簡易方法 [J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（6）：1 183-1 188.

[2]淳俊，鄭彥峰，王勝華，等.一種廣泛適用的RNA提取方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2008，35（5）：591-597.

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[7]錢程，趙敏，孫立娜，等.白囊耙齒菌（Irpex lacteus）總 RNA提取方法的建立[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，38（81）：1 389-1 391.

[8]胡文軍.靈芝中總RNA的提取[J].藥物生物技術(shù)，2005，12（3）：183-185.

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[10]薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W著.黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.3版[M].北京：科學(xué)出版社，2003：582-584.