李偉陳文佟長青孔亮曲敏譚成玉金橋李丹彤

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023;2.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱150040;3.大連海洋大學(xué)海洋環(huán)境工程學(xué)院,遼寧大連116023;4.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023)

菲律賓蛤仔凝集素的分離純化及抑菌活性研究

李偉1,陳文1,佟長青1、2,孔亮3,曲敏1,譚成玉3,金橋1,李丹彤4

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023;2.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱150040;3.大連海洋大學(xué)海洋環(huán)境工程學(xué)院,遼寧大連116023;4.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023)

采用Cellulose DE52離子交換層析、Sephadex G-100分子篩層析及TSK G3000PWXL凝膠色譜柱HPLC從菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum中分離純化出具有N-乙酰半乳糖酰胺 (N-acetyl-D-galactosamine,GalNAc)和豬胃黏蛋白 (Mucin from porcine stomach,PSM)特異性的菲律賓蛤仔凝集素 (簡稱為MCL-T)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明,MCL-T的相對分子量為148 000,含有62 000和36 000的亞基。抑菌試驗結(jié)果表明,MCL-T對金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis有較高的抑菌活性。對MCL-T中Trp殘基、-S-S-、-SH以及Tyr殘基進(jìn)行化學(xué)修飾后,MCL-T對金黃色葡萄球菌的抑菌活性喪失;對其-S-S-進(jìn)行化學(xué)修飾后,MCL-T對枯草芽孢桿菌的抑菌活性影響不大,而對其-SH、Trp殘基和Tyr殘基進(jìn)行化學(xué)修飾后,MCL-T對枯草芽孢桿菌的抑菌活性喪失。研究表明,MCL-T肽鏈上的氨基酸殘基狀態(tài)與其抑菌活性有關(guān)。

菲律賓蛤仔;凝集素;抗菌活性;化學(xué)修飾

凝集素是非酶及非免疫的蛋白質(zhì)或糖蛋白,廣泛存在于海洋動物、植物和微生物中,在生物機(jī)體中起著防御作用[1]。同時,凝集素還具有抗菌、促有絲分裂及抗病毒等多種生物學(xué)活性。有關(guān)海洋生物凝集素的抗菌活性已有很多報道,Gowda等[2]研究了從海參Holothuriascabra中分離的T-抗原特異性凝集素對一系列革蘭氏陽性菌和陰性菌的抗菌活性,并詳細(xì)研究了細(xì)菌表面雜多糖鏈的變化對凝集素凝集細(xì)菌活性的影響;Liao等[3]報道了從紅藻中分離的凝集素具有抗海洋弧菌活性;Tasumi等[4]報道了日本鰻魚Anguillajaponica皮膚黏液中的凝集素具有抑制大腸桿菌Escherichiacoli(K12)的活性。這些研究結(jié)果表明,海洋生物凝集素可以成為潛在的生物抗菌劑。

本研究中,作者分離純化了菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum凝集素,對其抑菌活性進(jìn)行了初步研究,并對其氨基酸殘基經(jīng)化學(xué)修飾后凝集素抑菌活性的變化進(jìn)行了研究,旨在探索凝集素結(jié)構(gòu)與抗菌活性之間的關(guān)系,為實現(xiàn)其在抗菌方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菲律賓蛤仔購于大連興工街農(nóng)貿(mào)市場;大腸桿菌Escherichiacoli、產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridiumperfringens、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis均取自遼寧出入境檢驗檢疫局。

高效液相色譜 (HPLC):色譜柱為 TSK G3000PWXL(4.6mm×300 mm),柱溫為室溫,流動相為0.01 mol/L磷酸鹽 (pH 7.4)緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 凝集素的分離純化 將菲律賓蛤仔研磨粉碎,用PBS(0.1 mol/L磷酸鹽,pH 7.8,含0.15 mol/LNaCl)在4℃下抽提過夜。將勻漿液離心20 min(5 000g),取上清液,加入(NH4)2SO4,使其飽和濃度達(dá)到80%,靜置過夜后,離心20 min (5 000g),收集沉淀。將沉淀溶于0.1 mol/L Tris -HCl(pH 7.8,含0.15 mol/L NaCl)緩沖液中,將溶液裝入透析袋中,透析除去 (NH4)2SO4后,冷凍干燥,得到凝集素粗品。

用TB(0.01 mol/L Tris-HCl,pH 7.8)緩沖液沖洗Cellulose DE52柱 (0.5 cm×10 cm)至吸光值 (A280nm)穩(wěn)定后,將粗品用少量TB緩沖液溶解后,加入到Cellulose DE52離子交換層析柱中,用含有0～1 mol/L NaCl的TB緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,測定血凝活性,收集具有血凝活性的組分,透析,冷凍干燥。將凍干樣品用少量TB緩沖液溶解,加入到Sephadex G-100分子篩層析柱 (2.5 cm×100 cm)中,用TB緩沖液進(jìn)行洗脫,收集具有血凝活性的組分,透析,冷凍干燥。再將凍干樣品溶于PBS中,離心 (4℃,10 000g)20 min,用0.45μm的微孔濾膜過濾,取20μL上清液,使用HPLC進(jìn)行純化,測定A280nm。

1.2.2 分子量的測定 采用SDS-PAGE電泳[5]方法測定分子量。

1.2.3 血凝活力的測定 在96孔U型微量血凝板中的每孔中加入25μL Tris-HCl緩沖液,往第1孔中加入25μL凝集素,混勻后,進(jìn)行倍比稀釋,最后在每孔中加入25μL含體積分?jǐn)?shù)為2%人B型紅細(xì)胞的Tris-HCl緩沖液,振蕩搖勻,在室溫下放置1 h后進(jìn)行觀察。以紅細(xì)胞凝集活力最大的稀釋度為該凝集素樣品的凝集活力 (凝集效價),記為2n[6]。

1.2.4 血凝抑制的測試 在96孔U型板中分別將各種抑制劑25μL連續(xù)倍比稀釋于等體積含0.15 mol/L NaCl的TB緩沖液中。然后在每個孔中分別加入25μL凝集素 (4倍血凝集活性),再加入25 μL體積分?jǐn)?shù)為2%的人B型紅細(xì)胞懸浮液。1 h后,測定每種抑制劑的最小抑制濃度。

1.2.5 抑菌活性的測定 將供試菌種用斜面培養(yǎng)基活化,以無菌生理鹽水制成106～107cfu/mL的菌懸液。采用濾紙片法測定凝集素的抑菌作用[7]。將厚約4 mm的濾紙打成直徑為6 mm的圓片,高壓滅菌。吸取0.1 mL各供試菌懸液,分別均勻涂布于平板培養(yǎng)基上。將濾紙片浸于凝集素溶液中,取出后晾干,再貼至平板上,以浸入無菌水中的濾紙片作為對照。于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈的直徑。

1.2.6 菲律賓蛤仔凝集素氨基酸殘基的化學(xué)修飾1)對凝集素中色氨酸殘基 (Trp)的修飾。N -溴代丁二酰亞胺 (NBS)可以與蛋白質(zhì)中的色氨酸 (Trp)發(fā)生反應(yīng)[8]。將凝集素溶于0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液 (pH 4.0)中,使其濃度為1.5 mg/mL。每次加入10μL 10 mmol/L NBS溶液 (用pH為4.0的0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液配制),間隔5 min測定A280nm。再次加入NBS,直至A280nm值不再下降為止,透析除去過量的NBS,冷凍干燥,測定其抑菌活性。

2)對凝集素氨基酸殘基中二硫鍵 (-S-S-)及巰基 (-SH)的修飾。1,4-二硫代蘇糖醇(DTT)可以還原蛋白質(zhì)中的-S-S-。用 PB (0.015 mol/L磷酸鹽,pH 7.2)緩沖液配制濃度為1.5 mg/mL的凝集素溶液,使DTT終濃度為20 mmol/L,室溫下反應(yīng)3 h后,透析除去過量的DTT,加入0.1 mol/L碘乙酸 (IA,用PB緩沖液配制),使凝集素終濃度為1.5 mg/mL,40℃下反應(yīng)10 min,透析,冷凍干燥,測定其抑菌活性。

N-乙基順丁烯二酰亞胺 (NEM)可以與-SH發(fā)生反應(yīng)[9]。用10μL 10 mmol/L NEM(用PB緩沖液配制)與凝集素進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)5 min后測定A300nm,之后每隔5 min加入NEM 10μL,反應(yīng)后測定A300nm,直到吸光值不再下降為止,透析,收集樣品濃縮,測定其抑菌活性。

3)對凝集素中酪氨酸殘基 (Tyr)的修飾。乙酰咪唑 (NAI)可以與乙酰化凝集素中的Tyr發(fā)生反應(yīng)[10]。用含0.15 mol/L NaCl的PB緩沖液溶解NAI,使NAI終濃度為135 mmol/L,凝集素終濃度為1.5 mg/mL,在30℃下反應(yīng)30 min后,透析,冷凍干燥,測定其抑菌活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 菲律賓蛤仔凝集素 (MCL-T)的分離純化

將菲律賓蛤仔勻漿后,取其上清液中的蛋白質(zhì),用飽和濃度為80%的 (NH4)2SO4沉淀,得到的蛋白質(zhì)具有80%的總血凝活性 (即回收率為80%)。將獲得的蛋白質(zhì)沉淀透析后進(jìn)行Cellulose DE52離子交換層析,將收集到的具有血凝活性的組分經(jīng)Sephadex G-100分子篩層析后,再收集具有血凝活性的蛋白峰組分,透析、冷凍干燥。將凍干樣品溶于 Tris-HCl緩沖液 (含 0.15 mol/L NaCl)中,經(jīng)過HPLC純化,發(fā)現(xiàn)第一個色譜峰具有血凝活性 (圖1-A),收集具有血凝活性的組分,再次經(jīng)過HPLC后,得到一個對稱的單一色譜峰,這表明該蛋白已經(jīng)達(dá)到色譜純 (圖1-B)。MCL-T經(jīng)過4步分離純化,得到MCL-T純化樣品,最終回收率為14%(表1)。

圖1 MCL-T的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of MCL-T

經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,沒有加入β-巰基乙醇的MCL-T出現(xiàn)相對分子量為148 000的蛋白質(zhì),而加入β-巰基乙醇的MCL-T則出現(xiàn)相對分子量為62 000和36 000的蛋白質(zhì) (圖2)。β-巰基乙醇可以還原蛋白質(zhì)中的二硫橋。這表明,MCL-T中含有不均一亞基,亞基間由二硫橋連接。

類似的研究有:2004年,Bulgakov等 發(fā)現(xiàn)的相對分子量為138 000的菲律賓蛤仔凝集素(MCL),含有相對分子量為74 000、34 000和30 000的亞基;2008年,Takahashi等[12]發(fā)現(xiàn)的相對分子量為70 000的菲律賓蛤仔凝集素 (MCL4),由相對分子量為58 000和43 000的亞基組成。

圖2 MCL-T的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of MCL-T

表1 菲律賓蛤仔凝集素的分離純化Tab.1 Isolation and purification of MCL-T from M anila clam

2.2 MCL-T的糖結(jié)合特性

血凝抑制試驗結(jié)果表明:D-葡萄糖 (DGlc)、D-半乳糖 (D-Gal)、D-甘露糖 (D-Man)、N-乙酰-D-葡萄糖酰胺在濃度為100 mmol/L時,對MCL-T血凝活性沒有抑制作用;而N-乙酰半乳糖酰胺 (N-acetyl-D-galactosamine,GalNAc)和豬胃黏蛋白 (Mucin from porcine stomach,PSM)對其血凝活性有抑制作用,最小抑制濃度分別為0.0057 mmol/L、0.032μg/mL。

已有報道,菲律賓蛤仔凝集素有 MCL、MCL1、MCL3、MCL4、唾液酸結(jié)合凝集素 (sialic acid-binding lectin)、rMCGal和 GST fused rMCGal[11-16]等 (表2)。MCL的糖特異性為末端非還原狀態(tài)的β-連接的GalNAc和末端非還原狀態(tài)的β -連接的半乳糖[11];MCL3的糖特異性為GalNAc、D-甘露糖、乳糖 (Lactose) 和棉子糖 (Raffinose)[13];MCL4的糖特異性為GalNAc、N-乙酰葡萄糖酰胺 (GlcNAc)、N-乙酰神經(jīng)氨酸 (NeuAc)、D-甘露糖、D-巖藻糖 (D-Fucose)和豬胃黏蛋白(PSM)[12];唾液酸結(jié)合凝集素的糖特異性為唾液酸[14];rMCGal和GST fused rMCGal的糖特異性均為D-Gal[15];MCL1[16]與MCL-T的糖特異性均為GalNAc、PSM,但二者分子量及亞基組成均不相同。從血凝抑制試驗結(jié)果及分子量測定來看,MCL -T是一種新的菲律賓蛤仔凝集素。

表2 文獻(xiàn)報道的菲律賓蛤仔凝集素Tab.2 The lectins from M anila clam Ruditapes philippinarum in references

2.3 MCL-T的抑菌活性

從表3可見:MCL-T對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出較高的抑菌活性;除DTT+IA修飾的MCL-T對枯草芽孢桿菌保留抑菌活性外,經(jīng)過其它化學(xué)修飾的MCL-T均失去抑菌活性。對MCL-T的Trp殘基、-S-S-、-SH以及Tyr殘基進(jìn)行修飾后,MCL-T對金黃色葡萄球菌的抑菌活性喪失;對其-S-S-進(jìn)行修飾后,MCL-T對枯草芽孢桿菌的抑菌活性影響不大,而對其-SH、Trp殘基和Tyr殘基進(jìn)行修飾后,MCL-T對枯草芽孢桿菌的抑菌活性喪失。這些結(jié)果表明,MCL-T中Trp、-S-S-、-SH和Tyr殘基與對金黃色葡萄球菌抑菌活性有關(guān),-SH、Trp殘基和Tyr殘基與對枯草芽孢桿菌抑菌活性有關(guān)。凝集素結(jié)構(gòu)的改變對其抑菌活性具有較大的影響。

表3 MCL-T的抑菌活性Tab.3 Antibacterial activity of MCL-T

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Isolation,purification and antibacterial activity of lectin from M anila clam Ruditapes philippinarum

LIWei1,CHENWen1,TONG Chang-qing1,2,KONG Liang3, QU Min1,TAN Cheng-yu3,JIN Qiao1,LIDan-tong4
(1.College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University/Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field,Ministry of Education,Harbin 150040,China;3.College of Marine Science and Environment,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;4.College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

A N-acetyl-D-galactosamine(GalNAc)-/mucin from porcine stomach(PSM)-specific lectin(MCL -T)was purified from Manila clamRuditapesphilippinarumusing a combination of ion exchange on Cellulose DE52 and gel filtration on Sephadex G-100 and HPLC on TSK-GEL G3000PWXL.Molecular weight of the MCL-T was determined by SDS-PAGE to be 148 000,containing two kinds of subunits,62 000 and 36 000.The MCL-Twas found to show the antibacterial activities againstStaphylococcusaureusandBacillussubtilis.The antibacterial activities toStaphylococcusaureuswas found to be disappeared in the MCL-T in which tryptophan residues,-S-S-, -SH and tyrosine residueswere chemically modified.The chemicalmodification of-S-S-in the MCL-T led to less effects on the antibacterial activities againstBacillussubtilis,but the chemicalmodification of its-SH,tryptophan residues and tyrosine residues resulted in losing antibacterial activities againstBacillussubtilis.The findings indicate that the patterns of the MCL-T amino acid residues is involved in the antibacterial activities.

Ruditapesphilippinarum;lectin;antibacterial activity;chemicalmodification

Q532

A

2012-05-14

國家自然科學(xué)基金資助項目 (31071612,21075012)

李偉 (1964-),男,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:aisingioro@hotmail.com

2095-1388(2012)04-0333-05