王貴花，徐運(yùn)強(qiáng)，王榮霞

(石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

我們模擬糞腸球菌在口腔內(nèi)的生存環(huán)境建立根管感染模型，檢測(cè)黃連，大黃，五味子，連翹四種中藥水煎劑對(duì)糞腸球菌的抑菌活性，并對(duì)本次實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 中藥水煎劑的制備 黃連，大黃，五味子，連翹四種中藥(購(gòu)自河北省藥材公司)各50g，分別加水文火煎至200ml成為濃度為0.25g/ml的藥液，過(guò)濾備用。

1.2 菌株及菌懸液的制備 收集石家莊市二院細(xì)菌室分離到的糞腸球菌臨床菌株共5株，來(lái)自醫(yī)院病人的各種標(biāo)本(痰，尿，便，分泌物)，經(jīng)上海復(fù)星佰珞微生物鑒定及藥敏分析儀(FB450R1)鑒定為糞腸球菌。經(jīng)過(guò)鑒定的糞腸球菌使用牛心腦浸液(BHI肉湯)混合增菌后備用(BHI肉湯購(gòu)自北京路橋)。菌種使用前先復(fù)蘇，再用BHI肉湯配成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊臉?biāo)準(zhǔn)菌液備用(透光度為80%T)。因BHI肉湯本身是淡黃色，調(diào)整菌液濁度時(shí)應(yīng)將本身的顏色除去。

1.3 樣本預(yù)備 收集新鮮單根管牙70顆，經(jīng)口腔科處理后，將牙根置于含有25ml BHI肉湯的試管中，1.1kg/cm2，121℃高溫、高壓滅菌 15min。

1.4 建立根管感染模型 用注射器把配制好的標(biāo)準(zhǔn)菌液分別注入70顆牙的根管中，再把牙根放到盛有標(biāo)準(zhǔn)菌液的試管中，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h后。取出牙根，用0.9%氯化鈉沖洗根管，無(wú)菌濾紙干燥根管，再用蠟把牙根固定于培養(yǎng)皿底部。為了創(chuàng)造厭氧環(huán)境，根管口一定要完全封閉。整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作。

1.5 殺菌效果觀察 將70顆牙根分成7組，每組10顆。分別為:陰性對(duì)照組，只加0.9%氯化鈉;甲醛甲酚(FC)組，黃連水煎劑組;五味子水煎劑組;大黃水煎劑組;連翹水煎劑組;陽(yáng)性對(duì)照組，加菌液和0.9%氯化鈉溶液。用注射器把各種消毒液分別注入除陰性和陽(yáng)性對(duì)照組牙的根管內(nèi)，將放置牙根的各組培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)。在3天和7天時(shí)分別取出5顆牙根，無(wú)菌操作，使用25#H型銼(日本MANI)去除根管內(nèi)消毒劑，以0.9%氯化鈉注射液沖洗、無(wú)菌濾紙干燥后，用慢速G鉆均勻磨取根管內(nèi)層牙本質(zhì)粉末，電子天平稱(chēng)取4mg粉末，置于含有20ml BHI肉湯的無(wú)菌試管內(nèi)，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72h后取出，用數(shù)字顯示比濁儀(100%T)(上海復(fù)星佰珞)測(cè)量肉湯的透光度并分別記錄2次的數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 18.0，計(jì)量資料用(s)表示，因各組數(shù)據(jù)方差不齊，多組計(jì)量資料的組間比較采用秩和檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組之間的兩兩比較用SNK法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

中藥水煎劑在相同濃度和環(huán)境條件下，大黃組3天，黃連組7天，F(xiàn)C組7天組間無(wú)差別;陰性對(duì)照組7天，五味子組3天組間無(wú)差別;黃連組3天，F(xiàn)C組3天組間無(wú)差別，其余各組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四種中藥對(duì)糞腸球菌的抑菌活性見(jiàn)表1。

表1 四種中藥對(duì)糞腸球菌的抑菌活性比較(s)

表1 四種中藥對(duì)糞腸球菌的抑菌活性比較(s)

分組 3天 7天P 81.42 ±1.30 69.63 ±2.75 ＜0.05 FC 組 78.50 ±0.92 66.92 ±3.23 ＜0.05五味子水煎劑 70.58±0.51 61.67±1.07 ＜0.05黃連水煎劑 77.08±1.46 66.67±1.37 ＜0.05連翹水煎劑 51.02±1.28 37.57±2.24 ＜0.05大黃水煎劑 65.00±2.53 57.60±2.75 ＜0.05陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照組49.70 ±1.07 37.33 ±1.27 ＜0.05

3 討論

糞腸球菌是導(dǎo)致根管治療失敗的重要原因，這點(diǎn)已經(jīng)得到臨床廣泛的認(rèn)同。但由于糞腸球菌對(duì)抗生素極易產(chǎn)生耐藥性，所以現(xiàn)在人們已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行中藥用于治療根管內(nèi)糞腸球菌的體外實(shí)驗(yàn)。

黃連具有廣譜抗菌作用，體外抑菌試驗(yàn)證明它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌的作用要比對(duì)革蘭氏陰性桿菌強(qiáng)，并且在低濃度時(shí)抑菌，高濃度時(shí)殺菌［1］。大黃也是有廣譜抗菌作用的中藥。連翹在體外有抗菌作用，它與黃連，黃芩組成的復(fù)方，體外抑菌比單用連翹時(shí)更強(qiáng)［2］。五味子有斂肺滋腎，澀精止瀉，生津斂汗的作用。有報(bào)道，五味子醇浸液在體外對(duì)金黃色葡萄球菌，白色葡萄球菌，和一些革蘭氏陰性桿菌有抗菌作用［3］;五味子煎劑對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)人型結(jié)核桿菌完全抑制［4］。人們對(duì)五味子的抑菌作用研究較少，對(duì)黃連，大黃，連翹用于根管治療的研究也不多。張洪波［5］等證實(shí)，對(duì)引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的糞腸球菌，黃連，大黃，五味子在體外高度敏感，連翹對(duì)該菌中度敏感。

我們使用離體牙根管制備根管感染模型［6］測(cè)定中藥的抑菌效果，把相同濃度的藥劑注入根管內(nèi)，以求最大限度的接近口腔環(huán)境和藥物使用途徑。通過(guò)取3天和7天的培養(yǎng)液進(jìn)行比濁，測(cè)定培養(yǎng)液的透光度來(lái)確定中藥的殺菌效果。

因中藥本身有顏色，所以在中藥抗菌試驗(yàn)中，使用比濁法的不多。一般比濁法是將中藥倍比稀釋?zhuān)∠嗤牧考尤肴鉁?，然后再把一定量的?xì)菌加入。培養(yǎng)一定時(shí)間后轉(zhuǎn)種至平板，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為該藥的效價(jià)［7］。因?yàn)檠栏奶厥饨Y(jié)構(gòu)，如果把菌液和藥液直接放入培養(yǎng)液中，細(xì)菌有可能進(jìn)不到根管內(nèi)，所以必須把糞腸球菌和藥液用注射器注入根管，確保成功建立根管模型。因?yàn)橐呀?jīng)用瓊脂稀釋法做了這幾種中藥的預(yù)試驗(yàn)，所以本實(shí)驗(yàn)取相同濃度的藥劑進(jìn)行比較。因比濁管底有牙本質(zhì)粉末存在，只能對(duì)上層液進(jìn)行測(cè)定。要想得到更為準(zhǔn)確的細(xì)菌量的變化，可以采用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗法［8］，根據(jù)BHI肉湯中蛋白質(zhì)含量的變化判讀菌量的變化。BHI肉湯在使用前測(cè)定蛋白質(zhì)含量并記錄，然后分別在3天和7天時(shí)先轉(zhuǎn)種上層液，再測(cè)定蛋白質(zhì)含量，那樣既確定了是否污染雜菌，又能得出消耗蛋白質(zhì)的精確數(shù)值，從而折算出細(xì)菌量的變化，從而對(duì)中藥水煎劑的效果做一個(gè)更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四種中藥水煎劑對(duì)糞腸球菌有不同程度的抑菌活性，黃連效果最好，其次是五味子和大黃，連翹的作用最差。對(duì)于連翹與黃芩，黃連組成的復(fù)方是否對(duì)糞腸球菌有抑菌作用有待于再次研究。本次試驗(yàn)方法可行，試驗(yàn)結(jié)果可信，可以為臨床應(yīng)用中藥進(jìn)行根管治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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