齊孟和，胡金鳳，寧 娜，云彩麟，陳乃宏

(1.天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050;2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059)

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種重要的生物信使分子，最早發(fā)現(xiàn)它的作用是作為心血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子。后來研究逐漸發(fā)現(xiàn)它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可作為一種神經(jīng)遞質(zhì)和信號(hào)分子來發(fā)揮效能，參與多種生理、病理過程。Stamler等［1］發(fā)現(xiàn)NO及其衍生物可以通過修飾蛋白質(zhì)巰基的方式而穩(wěn)定發(fā)揮其生物活性，由此明確了蛋白質(zhì)巰基亞硝基化(S-nitrosylation，SNO):NO及其衍生物作用于蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基(cysteine，Cys)的巰基(-SH)，使之生成-SNO。后續(xù)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了超過100種可發(fā)生SNO的底物［2］。近年來，由NO介導(dǎo)的蛋白質(zhì)SNO導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病發(fā)生已經(jīng)成為一個(gè)重要假說，成為研究神經(jīng)退行性疾病關(guān)注的熱點(diǎn)。

內(nèi)源性NO是由其前體物質(zhì)左旋精氨酸(L-arginine，LArg)與O2在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化作用下生成的:L-Arg接受還原氫(NADPH)提供的電子，并在Ca2+/CaM的協(xié)助下，發(fā)生羥化反應(yīng)生成中間產(chǎn)物N-ω-羥精氨酸，然后在NADPH和四氫生物蝶呤(BH4)的協(xié)助下，經(jīng)NOS作用，進(jìn)一步氧化生成NO和L-胍氨酸(L-citrulline)［3］。體內(nèi)眾多組織都可以生成NO，這是因?yàn)榻M織細(xì)胞內(nèi)均存在NOS，并且大腦中NOS的活性要高于其它任何組織。目前發(fā)現(xiàn)的 NOS有 3 種亞型［4］:神經(jīng)元型(nNOS/NOS1)、誘導(dǎo)型(iNOS/NOS2)、內(nèi)皮細(xì)胞型(eNOS/NOS3)，雖然3種亞型的NOS均參與NO的產(chǎn)生，但是由于特定的細(xì)胞分布和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它們?cè)诓±砗蜕砬闆r下的作用也是不同的。目前認(rèn)為，eNOS產(chǎn)生的NO具有神經(jīng)保護(hù)作用，而nNOS和iNOS激活產(chǎn)生過量的NO則具有神經(jīng)毒性作用。

內(nèi)源性NO發(fā)揮功能途徑之一是通過蛋白質(zhì)巰基亞硝基化的方式。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NO可促使一些特殊靶蛋白發(fā)生巰基亞硝基化，從而影響神經(jīng)元的活性和功能［5］。其中大部分蛋白質(zhì)的巰基亞硝基化會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡或死亡，但是也有部分蛋白如p21Ras、Bcl-2、Caspase-3等巰基亞硝基化可阻止細(xì)胞死亡而起到神經(jīng)保護(hù)作用［6］。因此，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活起到損傷作用還是保護(hù)作用，需要考慮其在腦組織中的功能水平、分布位置和形成階段等綜合效應(yīng)。

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases)是一種以神經(jīng)元退行性變?yōu)榛A(chǔ)的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要包括阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)及亨廷頓病(Huntington's disease，HD)等疾病。現(xiàn)研究已發(fā)現(xiàn)在多種神經(jīng)退行性疾病患者的腦組織中可以普遍觀察到硝化蛋白的聚集，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾究竟是如何參與了這些疾病的發(fā)生、發(fā)展?這成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)將近年來研究進(jìn)展概述如下。

1 蛋白質(zhì)巰基亞硝基化與AD

AD是一種以記憶力減退、認(rèn)知障礙為主要特征，多發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，其主要的病理學(xué)特點(diǎn)是:β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques，SP)，神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及特定腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元與突觸的缺失。近期發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化與AD的病理機(jī)制存在諸多廣泛的聯(lián)系。

1.1 發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1巰基亞硝基化與AD 發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是一個(gè)可以調(diào)解線粒體分裂的重要蛋白質(zhì)。Cho等［7］研究發(fā)現(xiàn)，Drp1氨基酸序列644位點(diǎn)的半胱氨酸殘基是發(fā)生SNO的位置，SNODrp1增加其二聚體形成和促進(jìn)Drp1的GTP酶活性，這些都是線粒體裂變必須的，從而導(dǎo)致線粒體過度分裂。另外還發(fā)現(xiàn)，暴露于Aβ寡聚體的Drp1會(huì)形成SNO-Drp1而導(dǎo)致突觸丟失，這證明Aβ寡聚體也可促進(jìn)Drp1的巰基亞硝基化，從而促進(jìn)線粒體裂變和神經(jīng)元損傷。最近報(bào)道［8］，nNOS在Aβ的形成過程中起到淀粉樣催化劑的作用。這些研究都表明，在AD的發(fā)生發(fā)展過程中，nNOS-NO-SNO-Drp1-Aβ這個(gè)復(fù)雜的相互影響的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系是對(duì)AD腦神經(jīng)毒性作用的重要機(jī)制之一。

1.2 載脂蛋白E巰基亞硝基化與AD 載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)對(duì)于遲發(fā)型AD是一個(gè)非常明顯的遺傳易感因子，同時(shí)也是對(duì)中樞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的維持和重建有不可替代的作用。其在腦內(nèi)有3種不同的亞型:ApoE2、ApoE3和ApoE4，3者的差異只是在氨基酸序列112與158位點(diǎn)上的半胱氨酸(Cys)與精氨酸(Arg)的區(qū)別，ApoE2的兩個(gè)位點(diǎn)均是Cys，ApoE3的兩個(gè)位點(diǎn)各有一個(gè)Cys和 Arg，ApoE4的兩個(gè)位點(diǎn)均是Arg。Abrams等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在nNOS穩(wěn)定過表達(dá)的HEK-293細(xì)胞模型中，ApoE2與ApoE3可被巰基亞硝基化，而ApoE4不能被巰基亞硝基化。又因ApoE2純合子在人腦中罕見，所以AD患者腦內(nèi)的SNO-ApoE主要是nNOS催化ApoE3氨基酸序列112位點(diǎn)的半胱氨酸殘基形成的，SNO-ApoE3可降低ApoE與低密度脂蛋白受體的結(jié)合而造成低密度脂蛋白受體丟失，從而增加患遲發(fā)型AD的風(fēng)險(xiǎn)。另外，ApoE除了脂質(zhì)代謝與神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系外，還可直接促進(jìn)神經(jīng)突起的延伸，這在重建受損神經(jīng)纖維中起到重要作用，當(dāng)ApoE發(fā)生巰基亞硝基化后，可能會(huì)影響其重建功能。這些提示SNO-ApoE可能在AD的病理機(jī)制中起到重要作用。

1.3 細(xì)胞周期依賴蛋白激酶巰基亞硝基化與AD 細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk)是主要參與腫瘤細(xì)胞增殖和死亡的蛋白激酶家族，但Cdk5與其它家族成員不同，它在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)。目前認(rèn)為，Cdk5的活性對(duì)于正常腦功能和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制都具有重要作用，Cdk5的過度興奮可使其具有神經(jīng)毒性而損傷神經(jīng)元。Qu等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Cdk5氨基酸序列83和157位點(diǎn)的半胱氨酸殘基是其發(fā)生SNO的位置。此外，他們還觀察到尸檢AD患者腦內(nèi)的SNO-Cdk5水平明顯升高，但正常人的腦組織中卻沒有這種現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SNO-Cdk5的形成會(huì)增強(qiáng)Aβ毒性，致使樹突棘損傷甚至缺失。因此，Cdk5的巰基亞硝基化通過使其活性增加而使Cdk5具備神經(jīng)毒性作用，提示這種異常的酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制可能參與了AD的病理過程。

1.4 10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因巰基亞硝基化與AD 10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，它支配磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號(hào)通路，在幾乎所有神經(jīng)元中都表達(dá)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能都有至關(guān)重要的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AD患者的腦組織中p-Akt升高而PTEN減少。Kwak等［11］研究發(fā)現(xiàn)，PTEN氨基酸序列的83位點(diǎn)半胱氨酸殘基是SNO的主要位置，并首次發(fā)現(xiàn)NO介導(dǎo)的PTEN的巰基亞硝基化可導(dǎo)致一系列翻譯后修飾，而調(diào)節(jié)PTEN的降解。PTEN的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致tau蛋白的過度磷酸化和聚集，表明SNO-PTEN可以間接促進(jìn)AD的病理過程。

1.5 熱休克蛋白90巰基亞硝基化與AD 熱休克蛋白90(heat shock protein90，Hsp90)作為分子伴侶對(duì)細(xì)胞中眾多信號(hào)蛋白的構(gòu)象成熟和功能穩(wěn)定進(jìn)行調(diào)控。以往研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90的水平升高可以維持tau蛋白與Aβ處于溶解狀態(tài)而防止它們的聚集。最近 Martínez-Ruiz等［12］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中的Hsp90可以被巰基亞硝基化，其氨基酸序列597位點(diǎn)的半胱氨酸殘基是發(fā)生SNO的位置，SNO-Hsp90抑制了它的ATP酶活性，取消了Hsp90作為分子伴侶的調(diào)控作用。因此，SNO-Hsp90可能會(huì)導(dǎo)致tau蛋白與Aβ的聚集而促使AD的發(fā)病。

目前對(duì)于AD發(fā)病有很多假說，越來越多的證據(jù)表明，一些AD相關(guān)重要蛋白質(zhì)的巰基亞硝基化參與AD的發(fā)生、發(fā)展，所以蛋白質(zhì)巰基亞硝基化可能是導(dǎo)致AD患者神經(jīng)元損傷的重要原因，但其具體機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步明確。

2 蛋白質(zhì)巰基亞硝基化與PD

PD是另一種發(fā)病率較高的的慢性進(jìn)展性神經(jīng)退行性疾病，其主要的病理特征是黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性病變，尸檢可見PD患者、PD動(dòng)物模型腦組織中存在路易小體(Lewy body)，殘存的神經(jīng)元中出現(xiàn)較多的α-突觸核蛋白(α-synuclein)聚集［13］。硝化應(yīng)激通過使蛋白質(zhì)巰基亞硝基化的方式參與PD病理發(fā)展過程已經(jīng)成為一個(gè)重要的假說。

2.1 甘油醛-3-磷酸脫氫酶巰基亞硝基化與PD 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是一種糖酵解途徑中的酶，在細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用;Siah1是一個(gè)以多種核蛋白、胞質(zhì)蛋白及膜蛋白為底物的E3泛素連接酶。Hara等［14］研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH氨基酸序列150位點(diǎn)的半胱氨酸殘基是發(fā)生SNO的位置，SNO-GAPDH的形成抑制其脫氫酶活性和抑制誘導(dǎo)酰基磷酸酶的活性，進(jìn)而引發(fā)與E3泛素連接酶Siahl的相互作用，形成GAPDH-Siah1復(fù)合體，利于與SNO-GAPDH易位入核，并在Siah1定位下造成泛素化介導(dǎo)的核靶蛋白降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在Hara等［15］另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MPTP處理的小鼠腦組織中SNO-GAPDH明顯增加，地普雷尼爾(丙炔苯丙胺)可以對(duì)抗MPTP誘導(dǎo)的毒性，同時(shí)減少紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的SNO-GAPDH增加，其機(jī)制可能是通過阻止GAPDH與Siah結(jié)合，而使SNO-GAPDH不能發(fā)生核易位，進(jìn)而阻止細(xì)胞死亡。由此可見，SNO-GAPDH直接參與PD發(fā)生、發(fā)展的病理過程，可以是調(diào)控PD治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

2.2 parkin蛋白巰基亞硝基化與PD parkin蛋白是一種E3泛素連接酶，在維持多巴胺能神經(jīng)元正常功能中發(fā)揮重要作用。它可催化特定的底物與泛素結(jié)合，即蛋白泛素化，這一過程有助于細(xì)胞移除和恢復(fù)異常折疊或破壞的蛋白質(zhì)。Chung等［16］研究發(fā)現(xiàn)，parkin蛋白氨基酸序列241和260位點(diǎn)半胱氨酸殘基是其發(fā)生SNO的位置，SNO-parkin失去其E3泛素連接酶的活性。另外，在缺乏線粒體復(fù)合物Ⅰ的動(dòng)物模型與散發(fā)性PD及彌漫性路易小體病患者的腦組織中均出現(xiàn)SNO-parkin，這說明parkin發(fā)生巰基亞硝基化，破壞了其泛素化異常蛋白及修復(fù)受損蛋白的功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。SNO-parkin可能是導(dǎo)致PD發(fā)生的重要因素。

2.3 過氧化氧化還原蛋白巰基亞硝基化與PD 過氧化氧化還原蛋白(peroxiredoxin，Prx)是一個(gè)利用硫氧還蛋白系統(tǒng)清除胞內(nèi)過氧化物的過氧化物酶類大家族，其家族成員Prx2在神經(jīng)元中大量存在。Prx2可以將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2。Fang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Prx2氨基酸序列51和172位點(diǎn)的半胱氨酸殘基是發(fā)生SNO的位置，SNO-Prx2的形成抑制了Prx2對(duì)H2O2的清除作用，說明Prx2的巰基亞硝基化損害了它的抗氧化功能。暴露于魚藤酮和MPP+的PD細(xì)胞模型會(huì)導(dǎo)致SNO-Prx2的產(chǎn)生，加入NO抑制劑后，Prx2的巰基亞硝基化明顯降低。另外，在形成路易小體的PD患者腦組織中發(fā)現(xiàn)SNO-Prx2明顯增加，而在AD患者和正常人的腦組織中卻沒有出現(xiàn)。這些研究均提示，SNO-Prx2使其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用受到損傷，進(jìn)而參與PD的病變過程。

2.4 X-連鎖凋亡抑制蛋白巰基亞硝基化與PD X-連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是凋亡抑制蛋白IAPs家族的重要成員，具有抑制細(xì)胞凋亡作用。它有兩個(gè)特征性的結(jié)構(gòu)域:一個(gè)是BIR結(jié)構(gòu)域，具有抗caspase的活性;另一個(gè)是Ring finger(環(huán)指結(jié)構(gòu)域)，具有E3泛素連接酶的作用。由于這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)半胱氨酸殘基，有可能成為巰基亞硝基化的潛在靶點(diǎn)。Nakamura等［18］研究發(fā)現(xiàn)，硝化應(yīng)激的條件下，XIAP的 BIR2-3，RING片段被巰基亞硝基化，其抗凋亡功能和E3泛素連接酶功能受到抑制，使caspase激活從而促進(jìn)神經(jīng)元死亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，XIAP氨基酸序列450位點(diǎn)的半胱氨酸殘基是發(fā)生SNO的位置。然而 Tsang等［19］研究認(rèn)為，NO主要修飾了BIR結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基，其抗凋亡作用受到抑制，但并未影響其作為E3泛素連接酶的活性。雖然對(duì)SNO發(fā)生的位置存在不同觀點(diǎn)，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PD患者和MPTP所致PD動(dòng)物模型腦組織中，SNO-XIAP水平明顯升高，這說明SNOXIAP可能對(duì)PD的病理過程起到促進(jìn)作用。

PD是一種發(fā)病機(jī)制不清楚的神經(jīng)退行性疾病，目前的研究表明，許多蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性異常與PD的發(fā)病相關(guān)，而這些蛋白質(zhì)中一部分會(huì)通過發(fā)生巰基亞硝基化誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷或凋亡，從而直接或間接導(dǎo)致PD的發(fā)生;不過也有一些蛋白質(zhì)不會(huì)發(fā)生巰基亞硝基化，因其不具有半胱氨酸殘基結(jié)構(gòu)，例如α-突觸核蛋白。蛋白質(zhì)巰基亞硝基化參與PD的具體機(jī)制尚不十分清楚，這將成為研究PD發(fā)病機(jī)制及蛋白質(zhì)巰基亞硝基化的有趣課題，有待深入。

3 蛋白質(zhì)巰基亞硝基化與其它神經(jīng)退行性疾病

ALS是一種危及生命，病理過程發(fā)展迅速的神經(jīng)退行性疾病，主要影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。超氧化物歧化酶(SOD1)突變體對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有毒性，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其在散發(fā)性ALS中常見。

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulphide isomerase，PDI)主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起到催化新生肽鏈的氧化折疊的作用。Walker等［20］研究發(fā)現(xiàn)，PDI的高表達(dá)可以降低SOD1突變體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和減少SOD1突變體的聚集，同時(shí)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。同時(shí)他們檢測(cè)了散發(fā)性ALS患者腰脊髓，發(fā)現(xiàn)了SNO-PDI的存在，雖然PDI表達(dá)增多，但SNO-PDI占了總PDI很大一部分比例，而PDI發(fā)生巰基亞硝基化使其失去了對(duì)抗SOD1突變體聚集及其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用，不能有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而加重ALS的發(fā)病。同樣的結(jié)果在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中也被觀察到。提示PDI發(fā)生巰基亞硝基化對(duì)ALS發(fā)病具有重要作用，可能是導(dǎo)致病變的機(jī)制之一，可以以此為切入點(diǎn)深入研究。

HD是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，主要是基底神經(jīng)節(jié)嚴(yán)重病變，表現(xiàn)為慢性不自覺的手舞足蹈。亨廷頓基因(Htt)的表達(dá)和線粒體功能障礙可能與HD的病理機(jī)制有關(guān)，突變型Htt直接損害線粒體膜電位、鈣穩(wěn)態(tài)以及軸突傳輸功能。

如前敘述，Drp1是一個(gè)可以調(diào)解線粒體分裂的重要蛋白質(zhì)，Drp1發(fā)生巰基亞硝基化后，會(huì)促進(jìn)線粒體的分裂，已經(jīng)觀察到SNO-Drp1出現(xiàn)在HD患者體內(nèi)，Wang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，突變型Htt通過抑制線粒體復(fù)合物融合來增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體分裂和降低ATP水平。同時(shí)，Liot等［22］研究發(fā)現(xiàn)，融合蛋白Mfn2可降低突變型Htt誘導(dǎo)線粒體分裂以及ATP的損失和細(xì)胞死亡，這證明線粒體功能障礙對(duì)HD發(fā)病非常重要。SNO-Drp1形成后會(huì)加劇線粒體的過度分裂，提示可能是在突變型Htt和SNO-Drp1的多重作用下，線粒體嚴(yán)重受損而導(dǎo)致HD的發(fā)病。另外，GAPDH及PDI的巰基亞硝基化也與HD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，其分子機(jī)制可能與前述GAPDH及PDI參與PD或ALS的發(fā)病機(jī)制有相似之處。

4 展望

綜上所述，自從發(fā)現(xiàn)NO可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾這一新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以來，其在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中的作用逐漸為人們所重視。雖然蛋白質(zhì)巰基亞硝基化的反應(yīng)機(jī)制、調(diào)控機(jī)制及特異性還不清楚，但越來越多的證據(jù)表明，諸如 GAPDH、parkin、PDI、XIAP等特殊靶蛋白的巰基亞硝基化已經(jīng)成為神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要參與者，因此，對(duì)于蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾的研究，將有助于確定治療神經(jīng)退行性疾病的新靶點(diǎn)，并為人們防治此類疾病提供新途徑，新思路。

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