陳 星，沈永義，張亞平,

(1. 云南大學 生物資源保護與利用實驗室，云南 昆明; 2. 中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與利用國家重點實驗室，云南 昆明)

生物進化論的核心包括適應進化機制(adaptive evolution)和選擇作用(selection)。其中適應性進化指生物在分支發(fā)展過程中, 局部結構和功能發(fā)生變化以適應特殊環(huán)境。在 1859年《物種起源》發(fā)表后的 100多年里, 自然選擇學說不斷發(fā)展完善, 基本上成為了進化論的主流。物種突變選擇可分為正選擇和負選擇(即純凈化選擇)(purifying selection)。正選擇(positive selection), 也稱達爾文選擇, 即當群體中出現能夠提高個體生存力及繁衍力的突變時,具有該基因型的個體較其它個體將更可能存活并遺留更多子代, 導致突變基因型最終得以在整個群體中擴散和固定?；蛩降倪m應性進化的一種重要方式即為基因通過正選擇得到積累并保持有利突變, 改變蛋白結構和功能, 進而適應外界變化(Shen, 2010)。線粒體DNA由于其具有進化速度快、母系遺傳及易擴增等優(yōu)點, 已成為分子進化研究中的好材料, 被許多研究所采用(Hebert et al, 2003;Schindel & Miller, 2005)。

1 線粒體DNA的基因組成

線粒體是存在于絕大多數真核細胞內的一種基本而重要的細胞器, 它通過氧化磷酸化為真核細胞提供＞95%的能量, 且擁有自身的遺傳物質和遺傳體系, 但由于基因組大小有限, 線粒體是一種半自主性的細胞器。不同生物線粒體的大小、數量及外觀等均不同(Coleman et al, 1991; Nosek et al, 1998;Unseld et al, 1997)。線粒體DNA (mtDNA)編碼呼吸鏈中氧化磷酸化所需的13種蛋白、22種tRNA和2種rRNA(16S和12S)(Gray et al, 1999)。其中, 與呼吸鏈有關的為復合物I (NADH：泛醌, 氧化還原酶,nad基因編碼)、復合物II (琥珀酸氧化還原酶, sdh基因編碼)、復合物III (泛醌：細胞色素C還原酶; cob基因編碼)、復合物IV (細胞色素C氧化酶; cox基因編碼)及復合物V (ATP合成酶, atp基因編碼)。線粒體中的蛋白質翻譯主要依靠其內部的 mRNA來完成, 通常, 5s rRNA含量非常稀少, 除了mtDNA自身編碼的一些重要功能蛋白之外, 核基因(nDNA)也會編碼一些特異蛋白并轉運至線粒體, 比如一些小RNA(small RNA)及轉運RNA(tRNA)。因此, 線粒體正常功能的行使還與核基因組有關 (Tzagoloff& Myers, 1986)。

雖然普遍認為 mtDNA是保守的 (Feagin et al,1988), 但是該基因組在不同生物中的基因數目、重排和表達在結構和大小上均呈現顯著變化(Cummings, 1992)。例如, 多數 mtDNA 為環(huán)狀(Oldenburg & Bendich, 1998), 但也有物種具線性mtDNA (Kayal et al, 2012)。線粒體基因組的大小從＜6 kb(惡性瘧原蟲)到＞200 kb (陸生植物)不等, 而擬南芥mtDNA是目前所測的最大的線粒體基因組(Allen, 2003), 為366 924 bp, 距離它較近的普氏立克次氏體真菌的線粒體基因組僅為其大小的 1/3(Andersson et al, 1998)。這種基因組大小的差異主要存在于非編碼區(qū), 擬南芥中有＞80%的非編碼區(qū), 立克次氏體中僅有24%, 而大多數原生生物的線粒體基因組則含有＜10%的非編碼序列 (Gray, 1998)。

mtDNA的全測序分析顯示基因種類變化的相似性 (Paquin et al, 1997)。頂覆蟲(變形蟲) mtDNA為5 966 bp, 僅編碼包括16S rRNA和12S rRNA三個蛋白, 無 5S rRNA或者 tRNA的基因; 人類mtDNA(16 569 bp)無5S rRNA的基因, 但含有13個與呼吸鏈有關的蛋白和用于轉運的最小量tRNA;擬南芥 mtDNA是人類 mtDNA的22倍, 含有5S rRNA的基因, 但所編碼的蛋白僅為人類線粒體的2.5倍 (32:13), 事實上, 擬南芥中的兩個 tRNA 基因在進化過程中混雜了葉綠體的基因組, 因此, 其線粒體基因組含有1% 的葉綠體基因組 (Unseld et al, 1997)。

2 線粒體的“內共生”起源及其進化

線粒體“內共生”起源學說的提出始于 19世紀, 之后隨著分子生物學手段的進步, Margulis(1970)又對其進行了進一步闡述?！皟裙采睂W說主要是指線粒體是一個早期共生于一個只含有細胞核的寄主細胞內的真細菌的直系后代 (Andersson et al, 1998; Lang et al, 1999; Gray et al, 1989; Gray&Doolittle, 1982)。應用rRNA序列進行的系統發(fā)育重建和線粒體全基因組掃描進一步支持了這一假說(Bonen et al, 1977; Yang et al, 1985)?？v觀這十年的研究發(fā)現, 線粒體基因組即為細菌基因組的一種形式?；蚪M測序的數據強有力地支持線粒體起源于α-變形菌門的一個亞群, 且為單系起源 (Andersson& Kurland, 1990)。在過去的幾年里, 大多數類似細菌 (原生動物異養(yǎng)鞭毛蟲)的線粒體基因組全測序完成和大多數似線粒體的真細菌 (普氏立克次氏體)基因組測序的完成, 成為目前劃分線粒體與其近緣真細菌之間界限的標志 (Andersson et al, 1998)。

在線粒體進化過程中, 其大小、編碼和非編碼基因的比例以及基因順序的保守性等均呈現不同的進化方向。植物 mtDNA出現擴張, 而動物mtDNA卻減少(Fraser et al, 1995, 1997, 1998;Himmelreich et al, 1996; Rivera et al, 1998), 尤其是在氨基酸合成、核苷酸合成、無氧糖酵解及其調控方面均出現大量缺失。通過比較普氏立克次氏體和異養(yǎng)鞭毛蟲的線粒體基因組可見, 在普氏立克次氏體中缺失的主要是一些生物合成的輔因子, 如脂肪酸和磷脂代謝的輔因子以及細胞膜合成及細胞分裂的輔因子等 (Rivera et al, 1998), 而這些“消失”的遺傳信息很大程度上固定在細胞核中, 并由細胞核進行表達和調控 (Covello & Gray, 1992)。

3 線粒體在分子進化研究中的應用

與核基因組相比較, 線粒體基因組具有其獨特的遺傳特性, 如母系遺傳、缺乏重組及進化速率快等。中性學說和“分子鐘”理論的提出奠定了進化生物學中“中性進化”理論的基礎 (Kimura, 1968)。很多恒溫動物系統發(fā)育關系的構建均基于此假說,且利用“標準的線粒體時鐘”來完成 (Klicka & Zink 1997; Aleixo, 2004)。同時, 動物的能量代謝絕大部分發(fā)生在線粒體, 生物運動能力的進化與線粒體的進化密切相關。利用線粒體基因組的比較從能量代謝的角度研究生物進化是一種有效的手段 (Shen,2010)。另外, mtDNA 的突變會導致某些蛋白功能的改變, 從而影響生物的適應能力, 利用生物信息學手段從分子角度研究mtDNA的突變將為后續(xù)的一些與線粒體相關的疾病研究提供基礎材料(Wallace, 2010)。

3.1 mtDNA用于重建物種的系統發(fā)育關系和分歧

時間估算

在以核苷酸或氨基酸替代率大致恒定的前提下, 通過觀察相關物種的核苷酸或氨基酸替代率來確定遺傳事件的發(fā)生, 稱為分子鐘假說(Zuckerkandl & Pauling, 1965)。目前, 利用分子鐘來估計物種的分歧時間以及重建生物進化的時間尺度被廣泛應用。把基因積累比作時鐘記錄下發(fā)生在不同時間的遺傳事件的方法, 為我們解決一些遺傳學問題提供了新思路?；驎r鐘有時也會產生隨機變化, 且各個事件改變的速率不同, 因此用系統發(fā)育學來解釋物種的分歧、擴張、遷徙以及新物種形成的時間顯得尤為重要（Avise, 2000)。利用mtDNA來重建系統發(fā)育關系, 特別那些基于 mtDNA全基因組重建的系統發(fā)育關系, 在解決物種起源和分歧問題上已經提供了較好的遺傳學證據（Torroni et al,2006; Underhill & Kivisild, 2007; Pereira et al,2009)。在很多恒溫動物的系統發(fā)育研究中可利用“標準線粒體時鐘”作為校對, 即在每百萬年里每一個物種的每一個位點的分子進化替換率為 0.01(Klicka & Zink, 1997; Aleixo, 2004)。這個標準的尺度最早是通過研究人類和黑猩猩mtDNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)獲得的, 并在后續(xù)研究鵝的兩個屬中得到證實 (Shields & Wilson, 1987)。在一棵進化樹中, 某一枝的新產生都是由進化過程中不斷積累的突變導致 (Brown et al, 1979; Wilson et al,1979; Shields & Wilson, 1987; Wilson et al, 1985)。值得注意的是, 所謂“新突變的積累”是指DNA在復制或減數分裂過程中出錯, 且錯誤在修復時未得以修正(通常應用于家系研究); 在種群中, 通常研究的是 DNA多態(tài)性, 并且在物種內研究這種多態(tài)性固定下來的概率(McDonald et al, 2006)。

基于上述原理, Ting (2008)通過對 mtDNA上4000 bp片段進行測序, 利用最大似然法和貝葉斯方法重建了現代疣猴之間的系統發(fā)育關系, 包括黑白相間、橄欖色和紅色的疣猴類群。建立的基因樹與之前基于形態(tài)學和化石研究的物種樹大致一樣。并且提示黑白相間、橄欖色和紅色疣猴在第三紀中新世晚期依次分歧, 到上新世形成物種, 證明了疣猴多樣性的出現比我們預期的要早, 且估計該多樣性是由疣猴的適應輻射所致。隨后, Meyer et al(2011)又利用1.8 kb線粒體基因來重建葉猴屬內的系統發(fā)育。其中包括了細胞色素 b (ctyb)、D-Loop和 tRNA 的中間體, 從分歧時間看, 葉猴屬進化過程中至少經過兩次適應輻射事件, 這個結果也支持最近一次對于葉猴屬分類關系的修改 (Meijaard &Groves, 2004)。隨著測序技術的不斷進步, 人們在重建系統發(fā)育關系時, 不僅采用mtDNA, 也采用核基因(nDNA)來共同構建系統發(fā)育樹。Wang et al(2012)利用mtDNA全基因組和44個非編碼核序列來重現疣猴之間的系統發(fā)育關系。在分別用mtDNA和核序列來建系統發(fā)育樹時, 長葉猴屬在進化樹上的位置有所不同, 但是在用 mtDNA和核序列共同分析時, 則可以排除之前亞洲葉猴之間的并系關系,并很好的支持亞洲和非洲葉猴的單系起源假說。除了在靈長目中應用mtDNA重建系統發(fā)育關系之外,很多通過形態(tài)學或化石證據很難鑒定其進化地位的種屬也可以利用分子學手段, 通過生物信息學分析, 為形態(tài)學方面的缺失提供互補的證據, 而mtDNA即為分子進化分析的一個良好材料。

由于 mtDNA 既有自身編碼的基因, 又受到核基因調控, 同時利用mtDNA與nDNA來構建系統發(fā)育樹將為解決物種分歧時間提供更有力的支持。但是在這個過程中, 由于不同物種 mtDNA的進化速率不同, 選擇合適的基因作為遺傳標記將成為利用mtDNA分子鐘重建系統發(fā)育樹的一個挑戰(zhàn)。

3.2 mtDNA的適應性進化

適應(adaptation)是生物進化的核心, 一般認為是生物為了在生存斗爭中更好地適應其所在環(huán)境而形成一定性狀的現象 (Li, 2005)。物種進化的過程中, 適應性表型不僅體現在生理或形態(tài)上的變化(如鯨魚為了適應海洋環(huán)境, 身體呈流線型、四肢退化及皮下脂肪層增厚等), 且其最終目的是將遺傳信息更有效地傳遞下去并擴散甚至固定。自然選擇對新生變異的作用方式一般包括純凈化選擇和正選擇 (Shen, 2010)。前者用于淘汰進化中的有害變異, 趨于維持物種穩(wěn)定, 后者則負責促進有利變異的擴散甚至固定, 與物種的適應性進化及物種形成相關(Swanson & Vacquier, 2002)。相對于負選擇和中性進化, 人們更關心的是正選擇事件, 因為此類基因往往蘊含有適應性進化, 在功能上產生革新。迄今已發(fā)現很多受正選擇作用的基因, 例如：ASPM(abnormal spindle-like microcephaly associated)基因被認為是大腦容量大小的決定性因子, 無義突變會導致小腦癥的發(fā)生(Bond et al, 2002), 該基因在人類進化支系以及人群中都受到正選擇 (Evans et al,2004; Kouprina et al, 2004; Mekel-Bobrov et al, 2005;Zhang, 2003)。從分子水平尋找自然選擇的靶位點已成為目前探討適應性進化分子機制的常用策略(Andolfatto, 2005)。

基于其在能量代謝上的重要性, mtDNA在各個現存物種中均受到強烈的純凈化選擇壓力以去除有害突變(Rand, 2001; Meiklejohn et al, 2007)。然而由于各物種對能量代謝的要求不同, 有些種類(比如能飛翔的鳥, 和跑得快的動物)需要更多的能量,那么它們的線粒體是不是也受到更大的選擇壓力？Shen et al (2009)通過比較飛行能力強及退化鳥類的 mtDNA后發(fā)現, 異義突變(Ka/Ks)值與飛行能力呈負相關, 即飛行能力弱的鳥類的 Ka/Ks值較高。這說明飛行能力弱的鳥類的mtDNA發(fā)生異義突變(有害突變)雖然也能影響其產生能量的效率,但是由于其能量需求低, 有害突變對其個體生存的影響相對較小, 因此, 自然選擇對此類有害突變的純凈化選擇壓力也相應較弱。而對于飛行能力強的鳥類, 由于其能耗需求高, 個體 mtDNA的有害突變則很容易影響個體的能量需求, 進而影響其存活,因此, 自然選擇對此類有害突變表現高壓力純凈化選擇。在哺乳動物中也可見類似的規(guī)律, 即 Ka/Ks比值與奔跑速度(運動能力)呈現負相關。該結果說明mtDNA的有害突變對需要高能耗物種的不利影響相對更大, 從而使得 mtDNA發(fā)生有害突變的個體受到更強烈的純凈化選擇壓力, 更容易被淘汰(Shen et al, 2009)。Bj?rnerfeldt et al (2006)發(fā)現隨著人類對狗的馴化, 家犬 mtDNA 相比較其祖先灰狼而言, 所受到的選擇壓力有所放松, 積累了較多的非同義突變, 相對野生灰狼, 馴化家犬有充足的食物, 在能量代謝上受到的壓力較小, 同時較多的突變也為人工選擇各種表型提供了更多的可選擇性。

以上例子均僅考慮由線粒體編碼的能量代謝相關基因在適應性進化過程中所受的選擇壓力。由于在能量代謝過程中, 氧化磷酸化(OXPHOS)不僅有mtDNA的參與, 還受到近百個核基因(具體數字,不同物種有差異)的協調 (Pagliarini et al, 2008), 在探索生物能量代謝過程中, 應該同時考慮兩者在能量代謝過程中的協同作用。隨著運動方式的劇變,比如不能飛行的原始哺乳動物進化為蝙蝠的過程中, 蝙蝠飛行的能量代謝率是相似體型陸生哺乳動物的 3～5倍(Thomas & Suthers, 1972; Maina,2000)。為了探索蝙蝠如何滿足飛行起源過程中能耗的急劇提升, Shen et al(2010)同時檢測了線粒體和核基因基因組, 發(fā)現其中 23.8%的 mtDNA和4.90% 的 nDNA共同編碼的氧化磷酸化相關基因受到正選擇。而由nDNA編碼作用于線粒體但并不參與氧化磷酸化的基因或其它nDNA受到正選擇的比例則相對較小。該結果提示相比較其他背景基因,能量代謝相關基因 (包括線粒體編碼和核基因編碼基因)在蝙蝠飛行適應性進化過程中起重要作用。

這一系列的研究揭示線粒體由于提供動物運動所需的絕大部分能量, 與動物運動進化密切相關。然而線粒體除了提供動物運動所需的自由能之外, 還提供保持體溫的熱能。而不同緯度的生物,由于所處環(huán)境的溫度不同, 對維持體溫熱能的需求也不同。那么不同溫度(緯度)環(huán)境下的物種, 其線粒體的選擇壓力是否也不同？Eduardo et al (2004)的研究發(fā)現mtDNA影響著人類在地球上不同緯度的分布。而Sun et al(2011)也證明不同溫度環(huán)境的魚,其線粒體所編碼的能量代謝基因受到的選擇壓力也不同。這些結果均說明線粒體的進化與物種所需求的維持體溫的熱能相關。

從mtDNA角度分析生物適應運動能力的進化,以及適應環(huán)境溫度變化的遺傳機制, 可為能量相關研究提供分子生物學方面的證據。盡管某些位點的改變仍需要通過蛋白功能實驗才能確定, 在基因水平上檢測所受到的選擇壓力仍然具有快捷、直觀的特點, 可以直接觀察到基因組水平的變異位點。因此, 利用基因水平研究為向導, 從宏觀角度去驗證基因與功能的關系將會是分子進化研究的新角度。而同時考慮線粒體和核基因編碼的能量代謝基因,將為我們了解能量代謝在生物體內的適應性進化提供更為全面的證據。

3.3 mtDNA 密碼子重定義對生物適應性的作用

隨著對不同生物的不同細胞器的全基因組測序, 可以發(fā)現有充分的證據證實相同遺傳密碼子并不如我們以前所想的那樣在所有生物中均翻譯為相同的氨基酸。在mtDNA中有很多例子可以證明(尤其在一些相關物種間)同一密碼子在某物種內編碼某種氨基酸, 而在另外一個物種內卻編碼另外一個氨基酸, 從一個終止密碼子變成一個編碼氨基酸的密碼子或從一個可編碼的密碼子變成一個終止密碼子。如果這種情況發(fā)生在翻譯環(huán)節(jié), 那么這個改變了含義的密碼子就被稱為 “密碼子重定義”(codon reassignment)( Knight et al, 2001;Yokobori et al, 2001)。這種新定義的密碼子通常出現在之前機體比較偏好的舊的密碼子的位置, 通常認為這種新定義的密碼子是有害的, 會隨著進化過程中的自然選擇而被逐漸清除掉。突變貫穿于整個基因組, 當突變發(fā)生時, 機體會對新產生的密碼子進行調適。目前關注的問題即為在機體尚未調適新密碼子時,這些略帶有害的新定義密碼子是如何在群體內固定下來的。

已有很多機制用于解釋這種mtDNA新定義的密碼子, 主要有：(1) 密碼子消失機制(codon disappearance, CD), 最早由 Osawa & Jukes (1989)提出, 即在獲得新定義的密碼子之前, 之前處于相同位置的密碼子先消失, 然后再由新定義的密碼子重新編碼; (2) 模糊的中間物機制(ambiguous intermediate, AI) 最早由Schultz & Yarus (1994)提出,即舊的密碼子不會消失, 而是在新定義密碼子之前出現一個模棱兩可的中間狀態(tài), 而tRNA可以同時轉運這兩種不同的氨基酸密碼子; (3) 未定義機制(unassigned codon, UC), 由Sengupta & Higgs(2005)提出, 即在新定義的密碼子未固定之前, 處于密碼子變化位置的密碼子不由任何tRNA翻譯; (4) 補償改變機制(compensatory change, CC), 由 Kimura(1985) 提出, 即新定義的密碼子單獨出現時有害,但和其他密碼子共同運用時就變得近中性而利于固定。

以上的機制均基于“獲得—丟失”的框架, 獲得為tRNA改變自己的互補密碼子來適應新的密碼子, 丟失則為tRNA從此停止轉運之前的舊的密碼子。Bender et al (2008)對人類和其他動物中不使用標準密碼子的 mtDNA 進行研究, 發(fā)現 AUA從在核基因內編碼異亮氨酸變化為在mtDNA里重新編碼蛋氨酸。實驗證實, 在活細胞中蛋氨酸表面的抗氧化結構可以為細胞提供良好的保護, 從而延長細胞壽命。這種在細胞呼吸鏈中蛋氨酸的重新定義,在進化過程中是一種適應性選擇, 在氧化磨損的選擇壓力下, 重新定義氨基酸從而形成自身的保護機制。除了AUA之外, 還有AAA在半索動物中編碼賴氨酸, 而在棘皮動物中則編碼天冬氨酸, 從而更利于棘皮動物的生存（Castresana et al, 1998)。

進化過程中, 生活環(huán)境不同, 受到的選擇壓力也不同, 生物會通過對密碼子重定義來合成對自身有利的蛋白, mtDNA 為我們研究密碼子在進化過程中重定義提供了很好的原料。同時, 研究這些密碼子重定義也可以使我們更好地了解線粒體進化歷史。

4 總 結

線粒體具有獨特的起源進化方式, 同時受到mtDNA 和 nDNA的雙重調節(jié), 因此線粒體基因、核基因、以及核-質基因相互作用的異常均會導致線粒體疾?。˙ourgeron et al, 1995)。這種在結構和功能上的特殊性使其成為我們在分子進化研究中的天然材料。線粒體是細胞的能量供應站, 對于mtDNA的研究, 為我們研究生物的能量代謝適應性進化的遺傳機制及動物的進化與線粒體進化的關系提供了很好的視角。通過對mtDNA突變的實驗研究, 結合nDNA的相互作用使得我們對能量代謝特異基因的突變在功能和生理上產生的影響有更深刻的理解, 并為疾病相關治療提供基礎。

線粒體基因組數量在動物進化中基本上趨于減少, 但其基因組進化速率卻高于核基因, 這不免會在進化過程中積累很多輕微有害的突變, 而很多mtDNA的功能由nDNA來調控, 甚至部分mtDNA已從線粒體中轉移至細胞核?；诖? Osada &Akashi (2012)提出了線粒體與細胞核的互償進化模式, 即表面看來 mtDNA 快速進化且積累一定的有害突變, 但是mtDNA 只是為nDNA 提供可選擇的材料, mtDNA 的有害部分會通過 nDNA 的調控來減少其有害性, 而一旦出現在選擇作用下具有適應性的基因, 將會從 mtDNA 轉移至 nDNA。因此,mtDNA看似積累有害突變, 其實是生物適應性的更好體現。在今后的分子進化研究中, 應該更多的把 mtDNA 和 nDNA結合起來考慮。在植物體中,由于線粒體基因組還會與葉綠體發(fā)生轉移, 故應該同時考慮葉綠體。這將會使mtDNA在分子進化研究中提供更多有用的信息。

隨著分子技術的進步, 應同時考慮線粒體編碼和核基因編碼的能量代謝相關基因在能量代謝適應性進化過程中的協調作用。利用基因水平研究為向導, 從宏觀的角度去驗證基因與功能的關系將為探討線粒體功能與分子進化的相互作用關系提供一個更為全面的視角。