王 芳, 陳 炯, 史雨紅, 陸新江, 李明云

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)室, 浙江 寧波 315211)

梅氏新貝尼登蟲(chóng)(Neobenedenia melleni)是一種海水魚(yú)類體表寄生蟲(chóng), 其宿主專一性低，且分布范圍廣, 寄生于高體鰤(Seriola dumerili)、大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)及日本黃姑魚(yú)(Argyrosomus japonicus)等百余種海水魚(yú)類的體表、眼、鰭、鰓和鼻等部位(Stephen et al, 2002; Whittington & Horton,1996; Zhang et al, 2002), 以宿主的表皮細(xì)胞和血液為食, 導(dǎo)致寄主寄生部位潰爛, 繼發(fā)細(xì)菌感染而死。梅氏新貝尼登蟲(chóng)生活史可簡(jiǎn)單劃分為3個(gè)典型的生理發(fā)育時(shí)期, 帶殼蟲(chóng)卵需5～7 d孵化成鉤毛蚴;鉤毛蚴逸出6 h后感染性大幅降低, 寄生于魚(yú)體表后鉤毛蚴發(fā)育為成蟲(chóng); 成蟲(chóng)存活周期一般為14～16 d (Jahn & Kuhn, 1932; Li et al, 2002)。我國(guó)東南沿海梅氏新貝尼登蟲(chóng)病的流行和爆發(fā)有典型的季節(jié)特征, 夏秋季感染率最高, 冬季不感染。研究表明魚(yú)類貝尼登蟲(chóng)的感染與海水溫度關(guān)系最大, 其次為降水量(Yang et al, 2004), 可見(jiàn)海水表層溫度和鹽度是影響梅氏新貝尼登蟲(chóng)生存的重要環(huán)境因素。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)能夠阻止蛋白變性, 參與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、折疊、解折疊、多聚體的組裝和拆解以及錯(cuò)誤折疊或聚集蛋白的降解(S?rensen et al, 2003), 在應(yīng)激狀態(tài)下, HSPs占細(xì)胞內(nèi)總蛋白的百分比能夠從常態(tài)時(shí)的 5%升高至15%或更高(Srivastava, 2002), 這類蛋白可能在保護(hù)寄生蟲(chóng)免受應(yīng)激損傷時(shí)發(fā)揮重要作用(Salem et al,2001)。其中熱休克蛋白60 (HSP60)是一類主要分布于線粒體且在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)。它能夠與原核和真核生物細(xì)胞內(nèi)的大部分蛋白相連接(Borges & Ramos, 2005), 協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)正確轉(zhuǎn)位、折疊和裝配。研究表明, HSP60是自身防御系統(tǒng)的預(yù)警信號(hào)(Ohashi et al, 2000), 其表達(dá)量可用于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的應(yīng)激檢測(cè) (Choresh et al, 2001)。鑒于HSP60在生命活動(dòng)中的重要功能, 本文克隆獲得梅氏新貝尼登蟲(chóng)HSP60 (NmHSP60)全長(zhǎng)基因, 選擇梅氏新貝尼登蟲(chóng)生活史中持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)階段, 分別用RT-qPCR和Western blot技術(shù)分析該基因 mRNA及蛋白表達(dá)與溫度應(yīng)激和鹽度脅迫的相關(guān)性, 為 NmHSP60功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

于浙江省寧波市象山黃避岙港灣采集大黃魚(yú)樣本并分離體表梅氏新貝尼登蟲(chóng)。成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵分別置于鹽度24溫度為18、25及32 ℃的過(guò)濾海水中, 2 h后收集并液氮速凍保存, 各溫度樣品單獨(dú)重復(fù)取樣3次。取成蟲(chóng)與蟲(chóng)卵分別置于25 ℃鹽度為18、24及30的過(guò)濾海水中, 5 h后收集, 液氮速凍后?70℃保存, 各鹽度樣品單獨(dú)重復(fù)取樣3次。

RNAiso 試劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0及SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司; Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司; BL21 pLys E和原核表達(dá)載體pET-28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存; 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG 購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和顯、定影試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所; 引物合成及序列測(cè)定由上海英駿生物工程公司完成。

1.2 梅氏新貝尼登蟲(chóng)NmHSP60基因cDNA全序列的獲得及分析

根據(jù)已知 HSP60的保守序列合成簡(jiǎn)并引物HSP60-3F: 5'-GGNATGAARTTYGAYCGHGG-3'(N=A, C, G or T; R=A or G; Y=C or T; H=A, C or T), 以梅氏新貝尼登蟲(chóng)混合樣cDNA為模板, 3'-RACE獲得NmHSP60基因cDNA的3'-端序列, 隨后根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物 NmHSP60-5R: 5'-CGAAA GCGAAGCCCTGAC-3', 5'-RACE獲得NmHSP60基因cDNA的5'-端序列。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)拼接及驗(yàn)證重疊序列同一性后作 BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析。信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用InterProScan程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/), 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SWISSMODEL程序(http://swissmodel.expasy.org/repository), 多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析采用MEGA 4.0 軟件(Tamura et al, 2007)。

1.3 梅氏新貝尼登蟲(chóng)應(yīng)激蟲(chóng)卵與成蟲(chóng)中NmHSP60基因mRNA的表達(dá)分析

用RNAiso試劑分別提取梅氏新貝尼登蟲(chóng)各樣品的總 RNA, 加入 DNase I (RNase-free)處理, 在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下以總RNA 為模板合成cDNA第一鏈, 20 μL合成體系包括0.5 μg總RNA、4 μL的5× 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、2 μL的dNTP混合物(每種10 mmol/L)、20 U的 RNase抑制劑、50 pmol的Oligo(dT)18引物和10 U的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)已知的NmHSP60基因cDNA序列設(shè)計(jì)RT-qPCR引物為NmHSP60F: 5'-CCGACGCTCTTAATGCTAC-3'和NmHSP60R: 5'-GGGCTTTCTTGACAATCTC-3',預(yù)期擴(kuò)增片段大小為150 bp; 根據(jù)梅氏新貝尼登蟲(chóng)內(nèi)參基因β-actin cDNA序列設(shè)計(jì)引物為Nm-actinF:5'-CTTTAGATTTCAACCAGGAG-3'和Nm-actinR:5'-TGCCACAGTATTCCCTTT-3', 預(yù)期擴(kuò)增片段大小為 162 bp。RT-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同Huang et al (2011)。采用 2-??Ct法(Livak & Schmittgen,2001)對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析, 獲得 NmHSP60基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 梅氏新貝尼登蟲(chóng) NmHSP60原核表達(dá)載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)和抗血清制備

根據(jù) NmHSP60基因的 ORF序列設(shè)計(jì)引物對(duì)pET-NmHSP60F:'(下劃線為添加的限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ的識(shí)別序列), 以梅氏新貝尼登蟲(chóng)cDNA為模板擴(kuò)增出NmHSP60基因ORF序列,PCR產(chǎn)物切膠純化后經(jīng)雙酶切插入pET-28a(+)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-NmHSP60。轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 pLys E菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá), 12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE電泳分離,切膠純化預(yù)期大小的目的條帶, 免疫ICR小鼠制備抗血清, ?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 梅氏新貝尼登蟲(chóng)應(yīng)激蟲(chóng)卵與成蟲(chóng)中NmHSP60蛋白表達(dá)變化分析

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上, 將NC膜浸入含5%脫脂奶粉的PBS-T中4 ℃封閉過(guò)夜; 一抗37 ℃搖床孵育2 h,PBS-T搖洗5次; 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG, 37 ℃搖床孵育1 h, PBS-T搖洗5次;ECL發(fā)光法進(jìn)行顯影, 膠片掃描后用Quantity One進(jìn)行灰度統(tǒng)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為 mean±SD, 采用 SPSS軟件(13.0)中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 梅氏新貝尼登蟲(chóng) NmHSP60基因序列及結(jié)構(gòu)分析

NmHSP60 基因全長(zhǎng)cDNA序列(EMBL登錄號(hào)FN908505)包含1 882個(gè)核苷酸, 起始密碼子ATG位于第38～40位, 終止密碼子TAA位于第1 766～1 768位, 推測(cè)編碼一個(gè)由576個(gè)氨基酸組成的分子量為 6.15×104的蛋白, N-端無(wú)信號(hào)肽, 其理論等電點(diǎn)為 5.23。NmHSP60基因氨基酸序列包含一個(gè)伴侶素HSP60家族標(biāo)記性位點(diǎn)(AAVEEGIVPGGG, aa 426—437)和一個(gè)位于 C端的 GGM 重復(fù)區(qū)域(GG MGGMGGMGGMGGMGGMGGMM, aa 555—576)。三維結(jié)構(gòu)分析表明, NmHSP60含有頂端結(jié)構(gòu)域(apical domain)、中間結(jié)構(gòu)域(intermediate domain)和赤道結(jié)構(gòu)域(equatorial domain)等3個(gè)典型HSP60蛋白結(jié)構(gòu)域, 其中赤道結(jié)構(gòu)域包含ATP結(jié)合位點(diǎn)及K+、Mg2+結(jié)合位點(diǎn)(Simons et al, 2004; Arnold et al,2006; Schwede et al, 2003; Guex et al, 1997)。

全長(zhǎng)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明, NmHSP60與曼氏血吸蟲(chóng)HSP60的同一性最高, 達(dá)79%。氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析揭示, NmHSP60與曼氏血吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)HSP60緊密成簇, 與其他物種進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 1)。

2.2 梅氏新貝尼登蟲(chóng)應(yīng)激蟲(chóng)卵與成蟲(chóng)中NmHSP60基因mRNA的表達(dá)分析

梅氏新貝尼登蟲(chóng)病爆發(fā)期采樣海區(qū)水溫通常為～25 ℃ , 本文以25 ℃為對(duì)照溫度對(duì)蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)階段分別進(jìn)行冷刺激(18 ℃ )和熱刺激(32 ℃ )處理。RT-qPCR結(jié)果顯示, 蟲(chóng)卵階段 NmHSP60基因mRNA表達(dá)量在冷刺激下降低至對(duì)照溫度時(shí)表達(dá)量的 0.25, 在熱刺激下其表達(dá)量無(wú)顯著變化，而成蟲(chóng)階段NmHSP60基因mRNA表達(dá)量在冷刺激下降低為對(duì)照溫度時(shí)的 0.45, 在熱刺激下則升高至對(duì)照溫度的1.3倍(圖2A)。

梅氏新貝尼登蟲(chóng)病爆發(fā)期采樣海區(qū)海水鹽度通常為24左右。本文以鹽度24為對(duì)照, 選擇梅氏新貝尼登蟲(chóng)蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)做低鹽(鹽度 18)和高鹽(鹽度30) 脅迫。RT-qPCR結(jié)果顯示, 在低鹽脅迫下蟲(chóng)卵階段NmHSP60基因 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著變化,在高鹽脅迫下其表達(dá)量顯著上調(diào)為對(duì)照鹽度時(shí)的3.19倍; 成蟲(chóng)階段NmHSP60基因mRNA在低鹽脅迫下表達(dá)量顯著降低, 約為對(duì)照鹽度時(shí)表達(dá)量的0.41, 在高鹽脅迫下無(wú)顯著變化(圖2B)。

2.3 梅氏新貝尼登蟲(chóng) NmHSP60基因的原核表達(dá)和其抗血清特異性Western blot檢測(cè)

經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的 pET28a-NmHSP60在 E.coli BL21 pLys E中融合表達(dá) (圖3A)。Quantity One軟件分析表明, 該融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為6.4×104, 與預(yù)期的 6.38×104(包含 6.15×104的NmHSP60和0.23×104融合肽段部分)相符。Western blot分析表明（圖3B), 原核表達(dá)融合蛋白能夠與抗體發(fā)生特異性反應(yīng), 證實(shí)該表達(dá)產(chǎn)物為預(yù)期產(chǎn)物,在成蟲(chóng)總蛋白中檢測(cè)到的條帶比融合表達(dá)蛋白略小, Quantity One軟件分析其相對(duì)分子質(zhì)量為6.15×104, 與理論計(jì)算分子量一致。

2.4 梅氏新貝尼登蟲(chóng)應(yīng)激蟲(chóng)卵與成蟲(chóng)中NmHSP60蛋白表達(dá)變化分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖 4), 蟲(chóng)卵階段NmHSP60含量經(jīng)冷刺激處理后下調(diào)為對(duì)照溫度時(shí)的 0.49, 經(jīng)熱刺激處理后無(wú)顯著變化; 成蟲(chóng)中NmHSP60含量經(jīng)冷刺激處理后下調(diào)至對(duì)照溫度時(shí)的0.60, 經(jīng)熱刺激處理后上調(diào)至對(duì)照溫度時(shí)的1.24倍。蟲(chóng)卵階段NmHSP60蛋白量在低鹽脅迫下無(wú)顯著變化, 在高鹽脅迫下上調(diào)至對(duì)照鹽度時(shí)的1.54倍;成蟲(chóng)中NmHSP60蛋白量在低鹽脅迫下降低為對(duì)照鹽度時(shí)的0.69, 在高鹽脅迫下無(wú)顯著變化。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明, NmHSP60蛋白表達(dá)變化與上述mRNA的表達(dá)變化一致。

圖1 基于NJ法構(gòu)建的動(dòng)物HSP60全長(zhǎng)氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of amino acid sequences of animal HSP60, based on neighbor-joining methodGenBank登錄號(hào)：人, HUMHSP60A; 黑猩猩, AK305549; 豬, JN007377; 大鼠, RNU68562; 非洲爪蟾, BC072058; 大西洋鮭, BT059657; 牙鲆,DQ250130; 赤點(diǎn)石斑魚(yú), HQ141338; 金魚(yú), DQ872653; 草魚(yú), HQ153829; 黑腳硬蜱, XM_002433677; 南美斑潛蠅, AY845949; 蝶蛹金小蜂, FJ798092;岡比亞按蚊, XM_318461; 梅氏新貝尼登蟲(chóng), FN908505; 曼氏血吸蟲(chóng), XM_002572286; 日本血吸蟲(chóng), AY813151。GenBank Accession numbers: Homo sapiens, HUMHSP60A; Pan troglodytes, AK305549; Sus scrofa, JN007377; Rattus norvegicus, RNU68562; Xenopus laevis, BC072058; Salmo salar, BT059657; Paralichthys olivaceus, DQ250130; Epinephelus akaara, HQ141338; Carassius auratus, DQ872653;Ctenopharyngodon idella, HQ153829; Ixodes scapularis, XM_002433677; Liriomyza huidobrensis, AY845949; Pteromalus puparum, FJ798092; Anopheles gambiae, XM_318461; Neobenedenia melleni, FN908505; Schistosoma mansoni, XM_002572286; Schistosoma japonicum, AY813151.

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NmHSP60基因mRNA表達(dá)變化Fig. 2 Expression changes analysis of NmHSP60 mRNA by RT-qPCRA：溫度脅迫; B：鹽度脅迫。A: Thermal stress challenge; B: Salinity stress challenge. *P＜0.05 (n=3).

3 討 論

本文測(cè)定了 NmHSP60基因全長(zhǎng) cDNA序列,推測(cè)編碼一個(gè)由576個(gè)氨基酸組成的分子量為6.15×104的蛋白, 該預(yù)測(cè)蛋白具有線粒體分子伴侶蛋白的典型特征。氨基酸序列同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析揭示, NmHSP60與曼氏血吸蟲(chóng)HSP60較相似。

梅氏新貝尼登蟲(chóng)在加勒比海、西大西洋、太平洋東部和中部以及紅海海域均有分布(Whittington& Horton, 1996), 在水溫為 19 ℃(Deveney et al,2001)和30 ℃(Li et al, 2002)時(shí)均有報(bào)道, 但迄今為止在寒帶海域未有發(fā)現(xiàn), 其蟲(chóng)卵在 25 ℃時(shí)孵化率最高, 低水溫(18 ℃)和高水溫(32 ℃)時(shí)孵化率均驟減 (Lin et al, 2008)。本文研究表明, 18 ℃時(shí)蟲(chóng)卵NmHSP60的表達(dá)顯著低于 25 ℃時(shí), 32 ℃時(shí)表達(dá)略低于 25 ℃時(shí), 但兩者無(wú)顯著差異; 成蟲(chóng)NmHSP60的溫度應(yīng)激表達(dá)模式與蟲(chóng)卵中的略有差異, 它隨溫度的升高表達(dá)顯著上升, 32 ℃時(shí)表達(dá)量顯著高于25℃時(shí), 揭示NmHSP60表達(dá)與環(huán)境溫度應(yīng)激相關(guān)。前人研究表明, 正常條件下HSP60以穩(wěn)定狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中, 當(dāng)機(jī)體受到脅迫時(shí), HSP60表達(dá)量增加, 以修復(fù)線粒體基質(zhì)中的變性蛋白(Langer & Neupert, 1991; Itoh et al,2002), 而 HSP60表達(dá)量的驟減會(huì)導(dǎo)致部分變性及不可溶的凝聚蛋白無(wú)法重新恢復(fù)天然構(gòu)象, 從而影響機(jī)體的正常生命活動(dòng)(Gong & Yu, 2004), 當(dāng)應(yīng)激過(guò)強(qiáng)引起 HSP60生理缺失時(shí), 酵母會(huì)停止生長(zhǎng)(Hallberg et al, 1993)。因此, 結(jié)合梅氏新貝尼登蟲(chóng)的分布和發(fā)病規(guī)律, 我們認(rèn)為 NmHSP60可能參與梅氏新貝尼登蟲(chóng)在高溫下生理功能的維持。

圖3 NmHSP60基因的原核表達(dá)和抗血清Western blot檢測(cè)Fig. 3 Prokaryotic expression and Western blot analysis ofNmHSP60A：重組NmHSP60的SDS-PAGE分析; B：Western blot 分析。M：低分子量蛋白Marker(×103); 1-2：重組質(zhì)粒pET28a-NmHSP60在BL21 pLys E中誘導(dǎo)0 h、3 h的表達(dá); 3：切膠純化蛋白; 4：陰性對(duì)照; 5：原核表達(dá)純化產(chǎn)物; 6：成蟲(chóng)總蛋白。A: SDS-PAGE analysis of recombinant NmHSP60; B: Western blot analysis.M: protein molecular weight standards; 1-2: total protein of BL21 pLys E/pET28a-NmHSP60- induced for 0 h, 3 h; 3: purified recombinant NmHSP60; 4: negative control; 5: purified recombinant NmHSP60; 6: total protein of adult N. melleni.

圖4 Western blot檢測(cè)NmHSP60蛋白表達(dá)變化Fig. 4 Expression changes analysis of NmHSP60 by Western blotA: 溫度脅迫; B: 鹽度脅迫。A:Thermal stress challenge; B:Salinity stress challenge. *P＜0.05 (n=3).

水生生物會(huì)面臨滲透脅迫問(wèn)題, 前人對(duì)梅氏新貝尼登蟲(chóng)蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)對(duì)環(huán)境鹽度的適應(yīng)性也做了一些研究, 發(fā)現(xiàn)海水鹽度為17.6～56.9時(shí)對(duì)蟲(chóng)卵發(fā)育沒(méi)有顯著影響(Lin et al, 2008), 但成蟲(chóng)對(duì)鹽度的變化敏感, 暴雨等造成的鹽度暫時(shí)性改變能導(dǎo)致成蟲(chóng)從宿主體表脫落(Lin et al, 2008; Yang et al,2004)。新近研究表明, HSP60可能參與調(diào)節(jié)梭子蟹(Portunus trituberculatus)在鹽度脅迫下的應(yīng)激響應(yīng)(Xu & Qin, 2012)。本文研究表明, 蟲(chóng)卵NmHSP60在鹽度18和24時(shí)表達(dá)無(wú)顯著性差異, 但鹽度升至30時(shí), 表達(dá)量顯著增加, HSP60高表達(dá)與鹽度脅迫相關(guān)(Xu & Qin, 2012), 所以雖然表觀上鹽度為18～30是對(duì)蟲(chóng)卵發(fā)育無(wú)顯著性影響(Lin et al, 2008),但較高的環(huán)境鹽度可能對(duì)蟲(chóng)卵仍有脅迫作用,NmHSP60的高表達(dá)可能是蟲(chóng)卵適應(yīng)高鹽環(huán)境的保護(hù)機(jī)制之一; 成蟲(chóng)NmHSP60在鹽度18時(shí)表達(dá)顯著低于鹽度24時(shí), 而鹽度升至30時(shí)表達(dá)與鹽度24時(shí)無(wú)顯著變化, 揭示成蟲(chóng) NmHSP60表達(dá)量與成蟲(chóng)對(duì)低鹽敏感及高鹽耐受的表征具有一定的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述, NmHSP60是梅氏新貝尼登蟲(chóng)一個(gè)重要的應(yīng)激相關(guān)因子。它在寄生蟲(chóng)溫度和鹽度等環(huán)境應(yīng)激中的作用分子機(jī)制將有待進(jìn)一步研究。