位爭偉 姜恩林 周燕

1 資料與方法

1.1 一般資料 以下所有材料均為正規(guī)公司及正規(guī)部門提供，所需材料為:細胞培養(yǎng)基、海藻酸鈉3 d支架、SD大鼠5只(每只質(zhì)量約為200 g)、鼠抗人CK14、鼠抗人CK15、山羊抗小鼠、掃描電鏡、細胞培養(yǎng)箱，以及倒置顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 對細胞的培養(yǎng) 選擇全層頭皮組織(越新鮮越好)，使用酶消化以及組織塊的方法分別對其進行分離，然后得到ORSC，培養(yǎng)P-L-L包被后，采用無血清法對K-SMF培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，實驗所用的均為原代細胞。采用酶消化法來獲得DPC，采用10%DMEM含量的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，實驗所用的均為第三代實驗用細胞。

1.2.2 構(gòu)建毛囊培養(yǎng)模型 分別將所獲得的原代ORSC以及三代內(nèi)的DPC收集在MSCM中，第一步，將兩種細胞的濃度分別進行調(diào)整，按照1比5的比例調(diào)勻后放置一邊備用;第二步，海藻酸鈉3 d支架的準備，為了保證該支架在力學(xué)上的性能，在對支架的使用之前，先為其添加一種Firming Buffer含量為10%的溶液，這樣可以有效加強支架的抗牽拉力以及彈性［1］;第三步，種子細胞的接種，將第一步中準備好的溶液均勻注射入第二步中準備好的支架表面，當(dāng)MSCM培養(yǎng)溶液將支架浸沒以后，將其放置在37℃的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每兩天進行一次溶液的置換。三個禮拜以后，為其進行液-氣界面之間的培養(yǎng)，培養(yǎng)四個禮拜。培養(yǎng)到第四個禮拜的時候，用甲醛含量為10%的溶液將一部分支架固定，采用石蠟的切片進行HE染色，并采用光鏡對支架的表面進行觀察，另外一部分則進行SD大鼠的皮下移植，以進行體內(nèi)實驗。

1.2.3 SD大鼠體內(nèi)實驗 采用0.11 ml/kg的水合氯醛為SD大鼠進行腹腔注射。對大鼠脫毛的區(qū)域進行鋪巾以及常規(guī)的消毒。用相應(yīng)的工具在大鼠的背部切開一道長度約1 cm的切口，進行皮膚至筋膜層的分離，將已經(jīng)培養(yǎng)了七個禮拜的3 d支架移植進大鼠的皮下，用絲線將支架模型固定在大鼠皮下，然后將大鼠切口縫合［2］。對大鼠的情況進行觀察。在移植后的第八個星期對大鼠的移植部位進行相關(guān)取材，觀察CK14、CK15以及波形蛋白免疫組化染色，探討其毛囊的結(jié)構(gòu)情況。

2 結(jié)果

對SD大鼠移植的部位進行取材后，我們發(fā)現(xiàn)可見的HE染色細胞聚集成為一團一團的毛囊樣結(jié)構(gòu)，在電鏡下的可見支架上，分布著散在細胞，CK14與CK15以及波形的蛋白染色呈現(xiàn)為陽性。

3 討論

想要將體外的毛囊進行重建，應(yīng)具備三個要素:第一，必須要有能讓毛囊進行分化的干細胞，具有真皮成分的細胞，起到了誘導(dǎo)毛囊的作用;第二，必須選擇能夠適合兩者進行體外重建的相關(guān)支架;第三，必須要有能夠模擬皮膚的相關(guān)體內(nèi)環(huán)境［3］。目前，大部分學(xué)者一致認為毛囊的隆空部位上有毛囊的干細胞，它是毛囊進行更新的源動力，其中起主要作用的是毛乳頭。本次研究，筆者選用種子細胞為DPC以及ORSC，這就很好地為毛囊的誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)打下了非常扎實的基礎(chǔ)。

綜上所述，可以得出以下結(jié)論:采用SD大鼠三維模型進行分離培養(yǎng)，能夠有效地將向毛囊逐漸分化的毛囊樣結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)出來，為將來的重建毛囊事業(yè)做出了非常有意義的探索。

［1］Commo S，Gaillard O，Bernard B.A1 human hair graying is linked to a specific depletion of hair follicle melanocytes affecting both the bulb and the outer root sheath.Br J Dermatol，2004，150(3):4352-4431.

［2］凡孝菊，陸偉，余春艷，徐軍軍，李裕強，金巖.SD大鼠毛乳頭細胞體外培養(yǎng)及組織工程皮膚的構(gòu)建.中國皮膚性病學(xué)雜志，2008，(06):198-200.

［3］劉昕，胡志奇，劉曉燕，吳越，官浩.雄激素與體外培養(yǎng)的人毛乳頭細胞和外根鞘細胞相互作用的研究.中國美容整形外科雜志，2006，(03):1212-1213.