燕榮帥 裴卓 馬小艮, 張一鳴 李玉紅

毛囊是具有周期性生長特性的一個特殊器官，在出生后，毛囊不斷經(jīng)歷生長期、退化期和靜止期的循環(huán)[1]。毛囊體積小，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜?？v切面觀察毛囊由外向里分為漏斗部、峽部、莖部和球部，與表皮呈一定角度；橫切面觀察毛囊由外向內(nèi)分為外根鞘、內(nèi)根鞘和毛干，呈同心圓排列。毛囊由十幾種細胞組成，除真皮乳頭和黑素細胞外，均來源于上皮細胞[2]。角蛋白在上皮細胞中表達最多，因此，角蛋白在毛囊的周期進展中扮演著重要的角色。在人頭皮毛囊，有散在的角蛋白表達研究的報道，但是并未系統(tǒng)研究其在毛囊周期中的表達情況[3]。小鼠毛囊周期和人毛囊周期的最大差異，在于其同步化，即一定時間段內(nèi)，各毛囊處于同一毛囊周期階段。根據(jù)文獻報道，小鼠毛囊細胞中有細胞角蛋白5（cytokeratin 5，Krt5）、細胞角蛋白 6（cytokeratin 6，Krt6）、細胞角蛋白 10（cytokeratin 10，Krt10）、細胞角蛋白 14（cytokeratin 14，Krt14）、細胞角蛋白 15（cytokeratin 15，Krt15）、細胞角蛋白 19（cytokeratin 19，Krt19）的表達，但均缺乏整個周期中的系統(tǒng)研究。本文根據(jù)經(jīng)典的毛囊分期方案[4]，選取了毛囊周期的幾個典型時期，包括毛囊發(fā)育期（出生后 1 d）、生長期啟動（出生后 29 d）、生長期（出生后7 d）、退化期（出生后 18 d）和靜止期（出生后 56 d），檢測前述角蛋白在毛囊細胞中的表達情況，對其進行分析，為闡明角蛋白在毛囊周期中的作用機制奠定基礎(chǔ)，為毛囊再生及毛囊周期調(diào)控研究提供借鑒。

材料和方法

一、主要材料

1.實驗動物：C57 BL/6小鼠購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，并在實驗動物中心進行飼養(yǎng)和實驗。

2.倫理聲明：實驗中所使用的動物符合我國微生物的控制要求，實驗設(shè)計、實驗過程及動物處死方法，經(jīng)過陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會審核，符合動物倫理和動物福利要求。實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（渝）20170002，使用許可證號為SYXK（渝）20170002。

3.主要試劑及耗材：多聚甲醛，無水乙醇，二甲苯，石蠟，兔抗 KRT5、KRT6、KRT10、KRT14、KRT15、KRT19抗體（中國生工生物工程有限公司），封閉用羊血清，AF488標記羊抗兔二抗（美國賽默飛世爾科技有限公司，），枸櫞酸鹽緩沖液，PBS，DAPI（中國碧云天生物技術(shù)公司），抗熒光猝滅封片劑，防脫組織切片。

二、主要方法

1.動物標本獲取：取 P1、P7、P18、P29、P56（出生后 1、7、18、29、56 d）的 C57BL/6 小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥100 μl；約5 min后，小鼠進入麻醉狀態(tài)，用剃毛器剃掉長出皮膚部分毛干，并用眼科剪剪掉未剃干凈毛干；用眼科剪剪取1 cm2的方形全層皮膚；將皮膚標本在PBS中簡單清洗后，在濾紙上攤開，修剪平整；標記好小鼠頭尾后，置于新鮮配制的4%多聚甲醛中，一起置于4 ℃冰箱。

2.動物標本處理：取材組織塊，經(jīng)4%多聚甲醛過夜固定后，按以下順序進行梯度脫水：50%乙醇2h→75%乙醇2 h→85%乙醇2h→95%的乙醇2h→100%乙醇Ⅰ1h→100%乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ15 min→二甲苯Ⅱ15 min；將組織塊置于預(yù)先融化的石蠟中浸泡4 h，石蠟包埋組織塊，注意包埋方向垂直瓶底，在石蠟切片機上進行切片，切片厚度為 5 μm。

3.免疫熒光：取前面獲取的切片，65 ℃烤片3 h；按一下順序進行梯度水合：二甲苯Ⅰ15 min→二 甲 苯Ⅱ15 min→100%乙醇I 3 min→100%乙醇Ⅱ3 min→95% 的 乙 醇3 min→85 %乙醇3 min→75 %乙醇3 min→50 %乙醇3 min→PBS 3 min；切片置于檸檬酸緩沖液，微波爐高火煮沸5 min，低火維持5 min；自然冷卻后取出，滴加稀釋后（1 : 50）的一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗，3 min×4 次；避光條件下，滴加AF488標記的二抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗，3 min×3次；滴加1 : 10000 稀釋的 DAPI，室溫孵育 10 min；PBS 沖洗后，用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

結(jié) 果

一、Krt5在毛囊周期中的表達特征

在毛囊發(fā)育期（圖1a），Krt5表達于毛囊漏斗部及毛母質(zhì)細胞。在生長期（圖1b），Krt5表達于外根鞘、內(nèi)根鞘及毛母質(zhì)細胞。在退化期（圖1c），Krt5表達于尚未凋亡的毛囊外根鞘及內(nèi)根鞘細胞。生長期啟動（圖1d），Krt5表達于所有的毛囊上皮結(jié)構(gòu)，包括次級毛芽、隆突區(qū)及外根鞘細胞。在靜止期（圖1e），Krt5表達于所有的毛囊上皮結(jié)構(gòu)，包括隆突區(qū)和外根鞘。在所有毛囊周期中，Krt5均表達于表皮的角質(zhì)層及表皮細胞，而不表達于毛囊的毛乳頭細胞；其表達模式均為細胞質(zhì)表達，在細胞核內(nèi)沒有表達。

圖1 正置熒光顯微鏡下觀察Krt5在毛囊周期中的表達（×400）

二、Krt6在毛囊周期中的表達特征

在毛囊發(fā)育期（圖2a），Krt6表達于毛囊外根鞘及內(nèi)根鞘細胞，在毛母質(zhì)細胞沒有表達。在生長期（圖2b），Krt6表達于外根鞘、內(nèi)根鞘及毛母質(zhì)細胞。在退化期（圖2c），Krt6表達于尚未凋亡的毛囊外根鞘及內(nèi)根鞘細胞。生長期啟動及靜止期（圖2d、2e），Krt6僅在毛囊外根鞘細胞有表達，在次級毛芽細胞沒有表達。在所有毛囊周期中，Krt6均表達于表皮的角質(zhì)層，在表皮細胞沒有表達，在毛囊的毛乳頭細胞也沒有表達；其表達模式均為細胞質(zhì)表達，在細胞核內(nèi)沒有表達。

圖2 正置熒光顯微鏡下觀察Krt6在毛囊周期中的表達（×400）

三、Krt10在毛囊周期中的表達特征

在毛囊發(fā)育期（圖3a），Krt10表達于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘及內(nèi)根鞘前體細胞。在生長期（圖3b），Krt10表達于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘及內(nèi)根鞘前體細胞。在退化期（圖3c），Krt10表達于尚未凋亡的毛囊內(nèi)根鞘細胞。生長期啟動（圖3d），Krt10表達于毛囊次級毛芽和隆突區(qū)細胞。在靜止期（圖3e），Krt10表達于毛囊隆突區(qū)，但僅限于隆突區(qū)內(nèi)側(cè)靠近毛干部分。在所有毛囊周期中，Krt10均表達于表皮的角質(zhì)層及除基底層以外表皮細胞，在毛囊的毛乳頭細胞始終沒有表達；其表達模式均為細胞質(zhì)表達，在細胞核內(nèi)沒有表達。

圖3 正置熒光顯微鏡下觀察Krt10在毛囊周期中的表達（×400）

四、Krt14在毛囊周期中的表達特征

在毛囊發(fā)育期（圖4a），Krt14表達于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘及內(nèi)根鞘、毛干前體細胞。在生長期（圖4b），Krt14表達于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘及內(nèi)根鞘、毛干前體細胞。在退化期（圖4c），Krt14表達于尚未凋亡的毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘及內(nèi)根鞘、毛干前體細胞。生長期啟動（圖4d），Krt14表達于毛囊漏斗部、次級毛芽和隆突區(qū)下段。在靜止期（圖4e），Krt14表達于毛囊漏斗部和隆突區(qū)，以及毛囊中部的部分外根鞘。在所有毛囊周期中，Krt14均表達于表皮細胞和皮脂腺細胞，在毛囊的毛乳頭細胞始終沒有表達；其表達模式均為細胞質(zhì)表達，在細胞核內(nèi)沒有表達。

五、Krt15在毛囊周期中的表達特征

在毛囊發(fā)育期（圖5a），Krt15表達于毛囊隆突區(qū)細胞。在生長期（圖5b），Krt15表達于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細胞。在退化期（圖5c），Krt15表達于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細胞。生長期啟動（圖5d），Krt15表達于毛囊次級毛芽和隆突區(qū)細胞。在靜止期（圖5e），Krt15表達于毛囊隆突區(qū)細胞。在所有毛囊周期中，Krt15均表達于表皮細胞，在毛囊的毛乳頭細胞始終沒有表達；其表達模式均為細胞質(zhì)表達，在細胞核內(nèi)沒有表達。

圖4 正置熒光顯微鏡下觀察Krt14在毛囊周期中的表達（×400）

圖5 正置熒光顯微鏡下觀察Krt15在毛囊周期中的表達（×400）

六、Krt19在毛囊周期中的表達特征

在毛囊發(fā)育期（圖6a），Krt19表達于毛囊隆突區(qū)。在生長期（圖6b），Krt19表達于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細胞。在退化期（圖6c），Krt19表達于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細胞。生長期啟動（圖6d），Krt19表達于毛囊次級毛芽和隆突區(qū)細胞。在靜止期（圖6e），Krt19表達于毛囊隆突區(qū)細胞。在所有毛囊周期中，Krt19均表達于基底層表皮細胞，在毛囊的毛乳頭細胞始終沒有表達；其表達模式均為細胞質(zhì)表達，在細胞核內(nèi)沒有表達。

圖6 正置熒光顯微鏡下觀察Krt19在毛囊周期中的表達（×400）

討 論

角蛋白是不溶性的纖維狀動物蛋白質(zhì)，是外胚層細胞的結(jié)構(gòu)蛋白?；毎缮L層移向表層成為角質(zhì)化細胞的過程中，不斷分泌角蛋白，且含量逐漸增加[5]。在毛囊的結(jié)構(gòu)維持中，角蛋白發(fā)揮著重要作用[6]，角蛋白甚至還參與腫瘤的發(fā)生[7]。因此，對角蛋白的研究一直是毛囊相關(guān)研究的重點[8]。在人的毛囊中，已有常見角蛋白的表達研究報道[9]。然而，在鳥類、嚙齒類動物中，卻僅有散在報道[10]。因為人的標本獲取困難，小鼠是最常見的研究模型。角蛋白在毛囊周期進程中也發(fā)揮著重要作用[11]，因此，對小鼠毛囊周期中角蛋白的表達情況研究顯得非常重要，可以為毛囊周期調(diào)控研究提供重要的數(shù)據(jù)支持。在毛囊研究中Krt5和Krt14常被作為毛囊結(jié)構(gòu)蛋白，顯示整個毛囊的上皮結(jié)構(gòu)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，在生長期和退化期Krt5和Krt14幾乎表達于所有的毛囊上皮細胞，它們可以用于顯示毛囊結(jié)構(gòu)；但是，在毛囊發(fā)育期和靜止期，Krt5和Krt14僅表達于部分毛囊上皮細胞，并不能用于顯示毛囊結(jié)構(gòu)。Krt6常被用作毛囊結(jié)構(gòu)蛋白，顯示毛囊內(nèi)根鞘[14-15]；本研究結(jié)果提示，在毛囊周期的各個時期的內(nèi)根鞘中均有Krt6的表達，因此，該蛋白適合顯示毛囊的內(nèi)根鞘細胞。和Krt6一樣，Krt10也常被用作毛囊結(jié)構(gòu)蛋白，顯示毛囊的內(nèi)根鞘；本研究結(jié)果提示，Krt10在毛囊發(fā)育期的毛球部均表達，在生長期啟動的次級毛芽也表達，而毛球部和次級毛芽結(jié)構(gòu)中主要是一些前體細胞，而不是已經(jīng)分化的內(nèi)根鞘細胞，所以Krt10并不適合顯示這兩個時期的內(nèi)根鞘。Krt15和Krt19常被用作表皮干細胞和毛囊干細胞的標記物[16-17]，用于干細胞研究[18]。研究證明，毛囊干細胞棲息于毛囊皮脂腺下方的隆突區(qū)。本研究結(jié)果提示：在靜止期，Krt15和Krt19均僅在毛囊隆突區(qū)表達，可以作為很好的毛囊干細胞標記物；在生長期啟動，Krt15和Krt19除了在毛囊隆突區(qū)表達外，還在次級毛芽表達，因此，表達這兩個角蛋白的細胞除了毛囊干細胞外，還有一些毛囊前體細胞和毛囊祖細胞；在生長期和退化期，Krt15和Krt19除了表達于隆突區(qū)外，還在毛囊下段的外根鞘表達，因此，表達這兩個角蛋白的細胞除了毛囊干細胞外，還有一些已分化的毛囊外根鞘細胞，因此，Krt15和Krt19并不適合作為毛囊干細胞標記物，用于這兩個時期的毛囊干細胞。對于Krt15作為毛囊干細胞標記物的合理性，以前也有報道提出質(zhì)疑[19]，與本研究結(jié)果一致。

總之，本文系統(tǒng)研究了常見毛囊角蛋白在小鼠毛囊周期中的表達特征，與既往研究相比，發(fā)現(xiàn)了過去使用中的一些誤區(qū)，供以后研究小鼠毛囊周期借鑒。包括：Krt5不適合作為毛囊發(fā)育期、生長期和退化期的毛囊上皮細胞標記物、Krt14不適合作為毛囊發(fā)育期和靜止期的毛囊上皮細胞標記物、Krt10不適合毛囊發(fā)育期和毛囊生長期啟動的毛囊內(nèi)根鞘細胞標記物、Krt15和Krt19不適合毛囊生長期和退化期的毛囊干細胞標記物。所檢測的幾種角蛋白作為毛囊結(jié)構(gòu)或毛囊干細胞標記物僅適用于特定的毛囊周期。因此，研究者在使用毛囊角蛋白作為標記物時，應(yīng)首先明確其在毛囊周期中的表達情況。當然，本研究的結(jié)論還需要更多的實驗來驗證?？梢钥紤]從以下兩方面進行進一步研究：一方面，本研究僅研究了這些角蛋白的蛋白表達情況，將來可以進一步研究這些角蛋白的mRNA原位表達情況，并與蛋白水平進行比較；另一方面，本研究僅使用了一家公司的抗體，對每個角蛋白也僅使用了一個抗體進行研究，將來可以使用其他公司或針對其他表位的抗體進行研究，抗體的不同也有可能得出不同的結(jié)果。