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艾拉莫德增強(qiáng)絲裂霉素C誘導(dǎo)的人食管癌Eca109細(xì)胞凋亡

2019-05-18 08:45:36吳昱王甲林
關(guān)鍵詞:絲裂霉素艾拉莫德

吳昱 王甲林

食管癌(esophageal cancer,EC)是常見(jiàn)的消化道腫瘤,是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。世界上79%的食管癌發(fā)生在中亞和東南亞,食管癌已成為中國(guó)第四大常見(jiàn)臨床診斷癌癥,也是中國(guó)癌癥相關(guān)死亡的三大主要原因之一[2]。即使采用聯(lián)合手術(shù)、化療和放療,食管癌的5年生存率< 20%,因此,增強(qiáng)食管癌放療和化療的敏感性是改善食管癌患者預(yù)后的重要途徑[3]。

艾拉莫德是一類(lèi)新型的抗風(fēng)濕類(lèi)藥物(diseasemodifying anti-rheumatic drugs,DMARDs),具有免疫調(diào)節(jié)功能。研究顯示,艾拉莫德能夠促進(jìn)單核細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力[4],但艾拉莫德在食管癌中的作用機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討艾拉莫德對(duì)食管癌增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

材料和方法

一、材料

(一)細(xì)胞系

人食管癌細(xì)胞系Eca109(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))

(二)實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國(guó)Gibico公司),絲裂霉素C(浙江海正藥業(yè)股份有限公司),艾拉莫德T-614(先聲藥業(yè)有限公司),CCK8(美國(guó)sigma公司),活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司),Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物科技有限公司),caspase3剪切體(cleaved caspase3)兔單抗,腫瘤壞死因子α(TNFα)兔單抗(美國(guó)CST公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人食管癌細(xì)胞系Eca109用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng),每2天換1次培養(yǎng)基,細(xì)胞匯合至80%以上傳代培養(yǎng)。

6孔板接種Eca109細(xì)胞,用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%~ 80%的時(shí)候,進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。對(duì)于CCK8和細(xì)胞活性氧檢測(cè)實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞分為 8 組,分別為 0,25,50,100 μg/ml濃度艾拉莫德(T-614)以及 0,25,50,100 μg/ml濃度艾拉莫德(T-614)+MMC(50 μg/ml),其中 0 μg/ml艾拉莫德為等體積的DMSO溶液。對(duì)于細(xì)胞凋亡和Western Blot實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞分為4組,分別為對(duì)照組、T-614(50 μg/ml)組、MMC(50 μg/ ml)組和 T-614(50 μg/ml)+MMC(50 μg/ml)組,其中對(duì)照組為加入等體積的DMSO代替T-614。于37 ℃、5%CO2正常培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、Western Blot和細(xì)胞活性氧檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

(二)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞死亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人食管癌細(xì)胞Eca109,0.25%胰酶消化離心,接種5×103個(gè)細(xì)胞于96孔板中,每孔200 μl體積,按上述分組處理培養(yǎng),每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μl體積的CCK8工作液,于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2.5 h后,于酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)定吸光值(A450),用A450值代表細(xì)胞活力。

(三)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集艾拉莫德T-614、絲裂霉素MMC和T-614+MMC聯(lián)合處理后的人食管癌細(xì)胞Eca109,離心洗滌后按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)加入流式緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μl Annexin V-FITC混勻,4 ℃避光孵育 30 min,再加 5 μl PI染液,孵育 5 min,立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng) Ex = 488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)Em = 530 nm,細(xì)胞凋亡率為早期凋亡(Q4)和晚期凋亡(Q2)細(xì)胞所占的比例數(shù)總和。

(四)Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取T-614、MMC和T-614+MMC聯(lián)合處理后的人食管癌細(xì)胞Eca109,加入蛋白裂解液收集細(xì)胞蛋白樣品,定量后取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入(1 : 500)稀釋的一抗(TNFα,cleaved caspase3,GAPDH),室溫孵育1 h。洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,洗滌后加入顯色液,成像拍照后進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

(五)細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè)

收集不同處理后的人食管癌細(xì)胞Eca109,用PBS洗滌細(xì)胞2次,并與10 μmol/L二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)工作液(1 : 1000稀釋?zhuān)┰?7 ℃下孵育30 min。隨后將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并通過(guò)熒光酶標(biāo)儀分析,488 nm激發(fā)波長(zhǎng),525 nm發(fā)射波長(zhǎng)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平表示為細(xì)胞的DCFH平均熒光強(qiáng)度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)CCK8、細(xì)胞凋亡、ROS檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)數(shù)據(jù)均采用表示。兩組間的比較采用t檢驗(yàn),多組間的比較采用單因素方差分析,以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、艾拉莫德抑制人食管癌Eca109細(xì)胞活力

CCK8結(jié)果所示,與0 μg/ml T-614組A450值(1.05±0.05)相比,50,100 μg/ml T-614 組A450 值(0.82±0.08,0.55±0.05)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 35.73,P< 0.01)。 與 0 μg/ml T-614+MMC組A450 值(0.85±0.03)比 較,25、50、100 μg/ml T-614+MMC 組A450 值(0.73±0.02,0.52±0.02,0.33±0.02)均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=127.60,P< 0.01)。這表明艾拉莫德 T-614 能夠增強(qiáng)MMC對(duì)人食管癌Eca109細(xì)胞活力的抑制能力。(表1)

二、艾拉莫德促進(jìn)食管癌Eca109細(xì)胞活性氧生成

細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)結(jié)果顯示,與0 μg/ mL T-614組 DCFH 熒 光 值(35.00±5.00)相 比,50、100 μg/ml T-614 組 DCFH 熒 光 值(90.00±10.00,136.67±15.28)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 74.71,P< 0.01)。與 0 μg/ml T-614+MMC組 DCFH 熒 光 值(130.00±10.00)比 較,25,50,100 μg/ml T-614+MMC 組 DCFH 值(219.67±9.50,280.33±10.50,338.33±16.07)均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 170.20,P< 0.01)。(表2)

表1 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后CCK8檢測(cè)Eca109細(xì)胞A450值(± s)

表1 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后CCK8檢測(cè)Eca109細(xì)胞A450值(± s)

注:與 0 μg/ml組比較,aP < 0.05

T-614分組濃度 樣本數(shù) T-614(A450) T-614+MMC(A450)0 μg/ml 31.05±0.050.85±0.0325 μg/ml 30.98±0.080.73±0.02a 50 μg/ml 30.82±0.08a 0.52±0.02a 100 μg/ml 30.55±0.05a 0.33±0.02a F值 35.73127.60 P值 < 0.0001 < 0.0001

表2 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后DCFH法檢測(cè)Eca109細(xì)胞DCFH熒光值(± s)

表2 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后DCFH法檢測(cè)Eca109細(xì)胞DCFH熒光值(± s)

注:與 0 μg/ml組比較,aP < 0.05

T-614分組濃度 樣本數(shù) T-614(DCFH) T-614+MMC(DCFH 0 μg/ml 335.00± 5.00130.00±10.0025 μg/ml 341.67± 1.53219.67± 9.50a 50 μg/ml 390.00±10.00a 280.33±10.50a 100 μg/ml 3136.67±15.28a 338.33±16.07a F值 74.71170.20 P值 < 0.0001 < 0.0001

三、艾拉莫德誘導(dǎo)食管癌Eca109細(xì)胞凋亡

如圖1流式檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率(5.33±0.35) %比較,T-614和MMC組的凋亡率(20.30±2.00) %,(25.60±3.00)%均升高。與MMC組細(xì)胞凋亡率(25.60±3.00) %比較,艾拉莫德與MMC聯(lián)用組(T-614+MMC)食管癌Eca109細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率(56.20±3.00) %升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 247.50,P< 0.01)。(圖 2)

四、艾拉莫德對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組TNFα和 cleaved caspase3蛋 白 表達(dá) 量(0.45±0.05,0.13±0.03)相比,T-614 組(0.85±0.05,0.25±0.02)和 MMC 組(0.87±0.06,0.25±0.03)Eca109 細(xì)胞 TNFα和 cleaved caspase3蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)。與 MMC 組(0.87±0.06,0.25±0.03)相比,艾拉莫德與MMC聯(lián)用組(T-614+MMC)食管癌Eca109細(xì)胞TNFα和cleaved caspase3蛋白表達(dá)(1.28±0.08,0.59±0.03)升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 96.90,P< 0.01)。(圖 3)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)艾拉莫德對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞凋亡的影響

圖2 艾拉莫德對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞凋亡的影響

圖3 艾拉莫德對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

討 論

食管癌系指由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡性病變[5]。世界每年死于食管癌者約為20萬(wàn)人。中國(guó)為食管癌高發(fā)國(guó)家,每年死于食管癌者約占中國(guó)惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/5[6]。早期食管癌患者應(yīng)首選手術(shù)治療。對(duì)中、晚期癌除作手術(shù)治療外,可采用放射治療、化學(xué)治療等[7]。目前雖應(yīng)用于食管癌的化療藥物較多,但確有療效者不多,其中最常用的藥物為絲裂霉素C(MMC)。聯(lián)合化療不僅用于中晚期食管癌,也用于與手術(shù)和放療的綜合治療[8]。因此,聯(lián)合化療方案可能是治療食管癌的重要方法。

艾拉莫德是一類(lèi)新型的小分子抗風(fēng)濕類(lèi)藥物,是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的小分子化合物[9]。研究表明,艾拉莫德通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體-γ來(lái)抑制破骨細(xì)胞生成[4]。最新研究表明,艾拉莫德在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中,能夠誘導(dǎo)患者外周血單核細(xì)胞的凋亡[10]。本研究推測(cè)艾拉莫德對(duì)食管癌也具有影響,基于該推論,本研究通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了艾拉莫德及其靶基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖和凋亡的影響,結(jié)果顯示艾拉莫德能夠抑制食管癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這與之前的研究結(jié)果一致。

ROS主要在線粒體中產(chǎn)生,作為正常細(xì)胞代謝的產(chǎn)物,ROS具有介導(dǎo)正常生理信號(hào)傳導(dǎo)的重要作用[11]。在正常生理?xiàng)l件下,ROS的生理水平刺激細(xì)胞增殖和存活,而ROS水平升高可損害許多細(xì)胞成分,例如脂質(zhì),蛋白質(zhì)和DNA,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[12]。ROS被認(rèn)為是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中細(xì)胞死亡和存活的重要信使分子,ROS濃度的變化在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用,被認(rèn)為是癌癥治療中有希望的治療方法[13]。艾拉莫德對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響還沒(méi)有研究證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能夠抑制食管癌細(xì)胞增殖,進(jìn)一步檢測(cè)了艾拉莫德對(duì)食管癌細(xì)胞ROS生成的影響。結(jié)果顯示,艾拉莫德能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞ROS生成,表明艾拉莫德抑制食管癌細(xì)胞活力可能與促進(jìn)食管癌細(xì)胞ROS生成有關(guān)。

細(xì)胞凋亡失調(diào)已被認(rèn)為是癌癥發(fā)展的最重要的生物學(xué)特征之一。細(xì)胞凋亡的執(zhí)行需要半胱天冬酶蛋白家族的精確協(xié)調(diào)[14]。Caspase-3,也稱(chēng)為死亡酶,在程序性細(xì)胞死亡的受控執(zhí)行階段起關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡信號(hào)引起細(xì)胞色素C的釋放,激活caspase-3,啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。TNF-α是一種具有高免疫能力的細(xì)胞因子,參與細(xì)胞增殖和凋亡,與多種炎癥性疾病和癌癥有關(guān)[16]。已經(jīng)證明TNF-α在癌癥的發(fā)生發(fā)展和治療中起相反作用。研究表明TNF-α通過(guò)與腫瘤細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合抑制細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。TNF-α還可通過(guò)激活信號(hào)通路,包括 ERK,p38MAPK、NF-κB 和caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18-20]。有研究表明,TNF-α能刺激活性氧(ROS)的釋放,消耗細(xì)胞谷胱甘肽,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡[21]。本研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,進(jìn)一步檢測(cè)了cleaved caspase 3和TNF-α的表達(dá)水平,結(jié)果顯示艾拉莫德能夠促進(jìn)cleaved- caspase 3的表達(dá)水平,促進(jìn)細(xì)胞因子TNF- α的表達(dá),表明艾拉莫德促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡可能與TNF-α和線粒體凋亡通路有關(guān)。

綜上所述,本研究證實(shí)了艾拉莫德能夠增強(qiáng)絲裂霉素對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109的細(xì)胞活力的抑制作用,并且促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成。艾拉莫德能夠促進(jìn)絲裂霉素誘導(dǎo)的人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞凋亡,并且能夠抑制細(xì)胞因子TNF-α和凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平。艾拉莫德調(diào)控食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞增殖和凋亡可能與IL-6和TGF-β的表達(dá)以及線粒體凋亡通路有關(guān),其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本課題研究結(jié)果有助于了解艾拉莫德在食管癌治療中的作用,為食管癌的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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