董忱 趙龍 張斌 陳虎

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是一群異質(zhì)的原始造血細(xì)胞,具有自我更新和多譜系分化2個(gè)基本特征。通過造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）可以實(shí)現(xiàn)長期多譜系重建造血系統(tǒng)，多用于治療退行性疾病和多種血液系統(tǒng)疾病。目前，HSCs的主要來源有骨髓（bone marrow，BM）、動(dòng)員的外周血（mobilized peripheral blood，mPB）、臍帶血（umbilical cord blood，CB）和胎盤（placenta）4個(gè)途徑，其中 CB HSCs具有人類白細(xì)胞抗原配型相合程度要求低，移植物抗宿主?。╣raft versus-host disease，GVHD）發(fā)病率低，采集方便、對(duì)供者無傷害且不存在倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，成為未來HSCT治療的優(yōu)先來源。

CB臨床應(yīng)用受限于HSCs數(shù)量較少，一般僅能滿足兒童和體重較輕的成人移植要求，而當(dāng)移植輸注HSCs數(shù)量不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者中性粒細(xì)胞恢復(fù)延遲，增加GVHD和移植相關(guān)死亡發(fā)生率。近年來，雙份臍帶血移植（cord blood transplantation，CBT）的實(shí)踐擴(kuò)展了其應(yīng)用，但有研究指出，雙份CBT沒有比單份CBT更具臨床優(yōu)勢(shì)，其血液學(xué)恢復(fù)并未得到改善。原因可能有三個(gè)方面：一是最終只有一份CB能導(dǎo)致長期造血；二是雙份CB聯(lián)合有較高的總有核細(xì)胞數(shù)，但每份CB的總有核細(xì)胞數(shù)不一定都比單份CB多；三是雙份CBT的移植物抗移植物效應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)GVHD發(fā)生，可能導(dǎo)致移植后血液學(xué)恢復(fù)受損[1]。

為了攻克CB應(yīng)用的瓶頸，探索最大限度擴(kuò)增CB HSCs又保證其生理功能不受影響的方法，國內(nèi)外研究者付出了諸多努力。本文重點(diǎn)回顧以小分子化合物（small-molecule compounds，SMCs）為首的CB HSCs離體擴(kuò)增的各種策略及其在移植模型和臨床試驗(yàn)中的貢獻(xiàn)。

一、細(xì)胞因子是最基本的擴(kuò)增工具

細(xì)胞因子在調(diào)控HSCs自我更新、增殖和分化等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，細(xì)胞因子是CB HSCs離體擴(kuò)增時(shí)不可或缺的基本因素[2]。其中，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶 3 配體（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)L），干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF），血小板生成素（thrombopoietin，TPO）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6是CB HSCs體外培養(yǎng)擴(kuò)增效果最佳的細(xì)胞因子組合[3]。其他有效細(xì)胞因子的加入可能以個(gè)體或協(xié)同方式增強(qiáng)擴(kuò)增作用，如Notch配體Delta-1和Jaggad-1，胰島素樣生長因子2（IGF-2），Sal樣蛋白4（SALL4）和復(fù)合蛋白TAT-BMI-1[4]等。但是，單純使用細(xì)胞因子或其組合不足以實(shí)現(xiàn)HSCs的高效擴(kuò)增，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長會(huì)導(dǎo)致離體培養(yǎng)的HSCs快速分化。最新研究發(fā)現(xiàn)，CHIR-99021，F(xiàn)orskolin和OAC1（CFO）的組合可以替代經(jīng)典細(xì)胞因子組合維持人CD34+細(xì)胞在體外有效擴(kuò)增[5]。若能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的化學(xué)替代，將為臨床應(yīng)用提供更多的便利和安全保障。

二、小分子是CB HSCs體外擴(kuò)增的有效激動(dòng)劑

SMCs來源易得，結(jié)構(gòu)明了，性質(zhì)穩(wěn)定，便于深入探究作用靶點(diǎn)和機(jī)制，并已長期應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中。在現(xiàn)行體外擴(kuò)增技術(shù)中，SMCs在提高功能性CB HSCs擴(kuò)增倍數(shù)上有重大突破（表1）。

（一） SR1

StemRegenin 1（SR1）是第1個(gè)針對(duì)體外擴(kuò)增CD34+CD133+細(xì)胞而從100000種化合物文庫中篩選發(fā)現(xiàn)的小分子激動(dòng)劑。2010年，Boitano等[6]首次報(bào)道嘌呤衍生物SR1可以促進(jìn)CB CD34+細(xì)胞的離體擴(kuò)增。研究表明，SR1與CD34+細(xì)胞的芳烴受體（AhR）直接結(jié)合并且是其有效的拮抗劑。研究發(fā)現(xiàn)SR1的作用有種屬選擇性，SR1可以抑制人AhR，輕微抑制小鼠AhR，但對(duì)大鼠AhR無抑制作用。HSCs移植于免疫缺陷小鼠是檢測(cè)功能性HSCs的金標(biāo)準(zhǔn)，這種差異可能表明人和小鼠的一些AhR相關(guān)途徑是不同的。

（二） UM171

2014年，F(xiàn)ares等[7]在超過5200種化合物的化學(xué)庫中通過兩級(jí)篩選，首先發(fā)現(xiàn)了一種嘧啶吲哚衍生物UM171，它可以在新開發(fā)的分批補(bǔ)料培養(yǎng)系統(tǒng)（fed-batch culture system）的幫助下擴(kuò)增CB CD34+CD45RA-細(xì)胞和表型定義的長期（long term，LT）-HSCs。當(dāng)與SR1組合使用時(shí)，擴(kuò)增效率會(huì)更高。但SR1損害了淋巴髓樣LT-HSCs的增殖潛力，優(yōu)先擴(kuò)增短期（short term，ST）-HSCs，而UM171優(yōu)先支持LT-HSCs的擴(kuò)增。轉(zhuǎn)錄組分析表明UM171不下調(diào)AhR途徑，但抑制了與紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞分化相關(guān)的基因。根據(jù)StemCell CKB計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)[8]，UM171可能通過作用于轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào)通路促進(jìn)CB HSCs離體擴(kuò)增。

表1 用于臍帶血造血干細(xì)胞離體擴(kuò)增的“明星”小分子化合物

（三） Oct4活化化合物1（OAC1）

轉(zhuǎn)錄因子Octamer結(jié)合蛋白4（OCT4）表達(dá)在胚胎干細(xì)胞和HSCs等多種成體干細(xì)胞中，在維持其全能性和多能性上起重要作用。Li等在小分子文庫篩選鑒定了可以促進(jìn)內(nèi)源性O(shè)ct4表達(dá)的OAC1。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)OAC1誘導(dǎo)的OCT4活化可以增強(qiáng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CB HSCs的自我更新，發(fā)現(xiàn)并鑒定了OCT4位于HOXB4上游，OCT4的活化通過上調(diào)HOXB4表達(dá)來增強(qiáng)HSCs的離體擴(kuò)增。

（四） PPAR-γ拮抗劑

2017年，Sertorio等[10]利用RNAi篩選發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ信號(hào)是人HSCs自我更新的負(fù)調(diào)節(jié)因子。Guo等[11]從74種核激素受體化合物文庫中篩選出PPAR-γ拮抗劑GW9662可以通過抑制CB HSCs分化和增強(qiáng)葡萄糖糖酵解促進(jìn)CB HSCs離體擴(kuò)增。機(jī)制研究還發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ的拮抗作用可以下調(diào)果糖-二磷酸酶1（FBP1，編碼糖酵解的負(fù)調(diào)控因子）表達(dá)，而FBP1的過表達(dá)也會(huì)抑制由PPAR-γ拮抗誘導(dǎo)的CB HSCs擴(kuò)增。

（五） p38-MAPK抑制劑

p38-絲裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）的激活與各種生理?xiàng)l件下HSCs衰老的發(fā)生有關(guān)。CB CD133+細(xì)胞的離體擴(kuò)增激活p38，其特異性抑制劑SB203580可以抑制CB HSCs的衰竭[12]。2018年，Bari等[13]通過構(gòu)效關(guān)系研究建立了1個(gè)包括50個(gè)SB203580類似物化合物文庫，通過篩選發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新型唑類小分子C7，它可以直接加入未經(jīng)富集的臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的離體培養(yǎng)體系中，有效擴(kuò)增表達(dá)CD90和 CD49f的 LT-HSCs。

（六） JNK-IN-8

JNK信號(hào)通路參與多能干細(xì)胞自我更新和白血病發(fā)生。2019年，Xiao等[14]通過篩選JNK通路相關(guān)小分子，發(fā)現(xiàn)其特異性抑制劑JNK-IN-8可以增強(qiáng)CB CD34+細(xì)胞的自我更新能力，有效離體擴(kuò)增LT-HSCs。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，JNK- IN- 8的處理下調(diào)了JUN基因和c-Jun mRNA的表達(dá)，降低了c-Jun蛋白的磷酸化水平。研究提示，JNK信號(hào)通路可能是一種調(diào)節(jié)人類HSCs擴(kuò)增的新型信號(hào)通路。

許多其他分子，如銅離子螯合劑四亞乙基五胺（TEPA）[15]和煙酰胺（nicotinamide，NAM）[16]可以促進(jìn)人CB CD34+CD38-細(xì)胞離體持續(xù)擴(kuò)增，提高體內(nèi)歸巢效率。前列腺素E2（PGE2）及其長效衍生物dmPGE2，組蛋白去乙?；傅囊种苿┣乓志谹（TSA），組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5azaD）和糖原合成酶激酶-3β抑制劑BIO等已經(jīng)被證明在改善臨床前模型的HSCs擴(kuò)增和（或）植入方面是成功的，下一步可能進(jìn)行臨床研究。

從研究成果來看，目前對(duì)這些小分子促進(jìn)HSCs擴(kuò)增的機(jī)制尚不明晰，SMCs基本都是通過海量篩選發(fā)現(xiàn)的，這無疑給研究者增添了實(shí)驗(yàn)成本和難度。因此，要高效地發(fā)現(xiàn)調(diào)控HSCs自我更新和增殖的小分子藥物，必須進(jìn)行深入的機(jī)制研究。

三、正在進(jìn)行的小分子擴(kuò)增臨床試驗(yàn)

（一） MGTA-456

Magenta Therapeutics公司將含有 SR1、FL、SCF、TPO和IL-6的培養(yǎng)基與CB CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)15 d后獲得的擴(kuò)增產(chǎn)品命名為MGTA-456。在先前的Ⅰ（Ⅱ）期安全性研究中（NCT01474681），18例患者接受了 MGTA-456和CD34-部分及1份未操作的CB共同移植，其中11例顯示出擴(kuò)增細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)植入和更快的造血重建，并且獲得持續(xù)造血[17-18]。在2018年4月11日，MGTA-456獲得了美國食品和藥物管理局（FDA）授予的孤兒藥資格。

（二） ECT-001

蒙特利爾Maisonneuve-Rosemont醫(yī)院的血液學(xué)專家組正在進(jìn)行UM171的安全性和有效性臨床試驗(yàn)研究（NCT02668315），將 CB CD34+細(xì)胞經(jīng)過 UM171共培養(yǎng)7 d的擴(kuò)增產(chǎn)物稱為ECT-001。在2018年第16屆國際臍帶血論壇上，該專家組匯報(bào)ECT-001可以讓患者更早獲益，比接受外周血或BM移植的患者更早退燒，平均住院時(shí)間減少11 d[19]。研究者提出ECT-001導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞的更早植入為患者提供了的抗感染防御機(jī)制；ECT-001含有較高比例的樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞前體，可以促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)從而減少腸道細(xì)菌移位并降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；ECT-001對(duì)CB大小要求較低，因此更多患者能夠接受HLA匹配更好的CB[19]。一項(xiàng)Ⅰ（Ⅱ）期開放性研究（NCT03441958）正在招募20例患者進(jìn)一步評(píng)估ECT-001作為一種新型治療策略治療高危多發(fā)性骨髓瘤患者的安全性和有效性。

（三） StemEx

Gamida Cell公司開發(fā)了 StemEx，即含有 TEPA、FL、SCF、TPO和IL-6的培養(yǎng)基與CB CD133+細(xì)胞共培養(yǎng)21 d后得到的移植物。在MD安德森癌癥中心進(jìn)行的Ⅰ（Ⅱ）期臨床試驗(yàn)驗(yàn)證了StemEx是安全可行的[20]。接著，Gamida Cell啟動(dòng)了一項(xiàng)多國Ⅱ（Ⅲ）期登記試驗(yàn)（NCT00469729），來自美國、歐洲和以色列的25個(gè)干細(xì)胞移植中心的101例患有高危白血病和淋巴瘤的受試者參與了該試驗(yàn)。與同期國際血液和骨髓移植研究中心登記的接受雙份臍帶血移植（DUCBT）的患者（n= 295）相比，提高了100 d存活率，同時(shí)促進(jìn)BM和血小板植入[21]。

表2 小分子化合物離體擴(kuò)增臍帶血造血干細(xì)胞的臨床試驗(yàn)

（四） NiCord

Gamida Cell支持的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT01221857）中，移植物NiCord由NAM共培養(yǎng)CB CD133+細(xì)胞21 d的擴(kuò)增部分和非培養(yǎng)的T細(xì)胞部分共同組成，在11例患者中有8例患者觀察到NiCord中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞穩(wěn)定植入[22]。2016年，一項(xiàng)NiCord治療血液系統(tǒng)惡性疾病的Ⅲ期多中心對(duì)照研究（NCT02730299）啟動(dòng)，計(jì)劃入組120人，若順利完成，NiCord離臨床使用將又前進(jìn)一大步[23]。NiCord已經(jīng)獲得了美國FDA授予的突破性療法認(rèn)定（首次認(rèn)定的干細(xì)胞移植技術(shù)）和FDA及歐洲藥品管理局（EMA）授予的孤兒藥資格。

四、單個(gè)表觀遺傳修飾多路徑影響CB HSCs擴(kuò)增

N6-甲基腺苷（m6A）是真核信使RNA上最豐富的表觀遺傳標(biāo)記。許多參與CB HSCs自我更新的轉(zhuǎn)錄因子都是通過m6A修飾來標(biāo)記的，如Gata2，Tal1，Etv6和Stat55等。2018年，Li等[24]發(fā)現(xiàn) m6A修飾被YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白（YTHDF）識(shí)別，其中YTHDF2結(jié)合m6A修飾的mRNA后促使mRNA降解，而YTHDF2缺陷會(huì)導(dǎo)致m6A修飾的mRNA的穩(wěn)定性延長，上調(diào)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，敲低YTHDF2可以使CB HSCs數(shù)量增加，并且在免疫缺陷小鼠體內(nèi)具有長期植入能力。通過單個(gè)表觀遺傳修飾可以多靶點(diǎn)、多路徑地影響CB HSCs自我更新，這比其他專注于單個(gè)靶點(diǎn)或途徑的研究更為高效。鑒定YTHDF2的特異性小分子抑制劑可能成為改善CB HSCs移植的新熱點(diǎn)[25]。

五、共培養(yǎng)系統(tǒng)提供重要的擴(kuò)增微環(huán)境

人胎肝和BM造血龕是支持HSCs存在的特定微環(huán)境，由不同類型的細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子和趨化因子組成，通過與HSCs接觸嚴(yán)格調(diào)控HSCs的靜止、自我更新、增殖和分化等生命活動(dòng)[2]。1977年，Dexter等[26]使用BM基質(zhì)細(xì)胞作滋養(yǎng)層，發(fā)現(xiàn)有助于HSCs離體長期培養(yǎng)，由此促進(jìn)了共培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展。目前，HSCs-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）共培養(yǎng)系統(tǒng)被定位為支持HSCs離體擴(kuò)增最有價(jià)值的平臺(tái)[27-28]。近期研究發(fā)現(xiàn)，人胎肝CD34loCD133lo細(xì)胞能夠有效支持HSCs的離體擴(kuò)增[29]。但共培養(yǎng)系統(tǒng)中滋養(yǎng)層細(xì)胞的變異因素是不穩(wěn)定的，這也是阻礙共培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)問題。

六、低氧培養(yǎng)有助于CB HSCs離體擴(kuò)增

在穩(wěn)態(tài)條件下，HSCs所處的體內(nèi)微環(huán)境是低氧的（1 ～ 6% O2），HSCs自 身 也 表現(xiàn) 為 細(xì) 胞 內(nèi) 缺 氧 狀 態(tài)（0.1 ～ 1% O2）。HSCs依賴于糖酵解代謝維持靜止，HSCs表達(dá)的缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α在常氧條件下易快速降解，在低氧條件下可以穩(wěn)定存在并與HIF-1β結(jié)合，激活糖酵解，促進(jìn)HSCs自我更新[30]。在缺（低）氧條件下，CXCR4（CD184）基因表達(dá)增加并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即歸巢能力增強(qiáng)[31]。使用抗氧化劑或p38 MAPK抑制劑可以維持低活性氧（ROS）水平，利于保護(hù)HSCs免受氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞衰老和分化。因此，如何通過ROS濃度的藥理學(xué)調(diào)節(jié)以及ROS信號(hào)傳導(dǎo)途徑來促進(jìn)離體HSCs擴(kuò)增，仍有待進(jìn)一步探索[32]。

隨著對(duì)HSCs自我更新和增殖機(jī)制的理解及探索，對(duì)SMCs高通量篩選方法的革新，越來越多的科研成果證明了CB HSCs體外擴(kuò)增的可行性。在目前的離體擴(kuò)增方法中，細(xì)胞因子被認(rèn)為是必不可少的，細(xì)胞因子聯(lián)合SMCs進(jìn)行高效率的擴(kuò)增顯示出HSCs體外擴(kuò)增的強(qiáng)大潛力?？茖W(xué)家們對(duì)細(xì)胞因子的化學(xué)取代也在進(jìn)行探索并取得了一些成果，這對(duì)將CB HSCs離體擴(kuò)增產(chǎn)物向臨床批量化標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)有重要意義。此外，SMCs主要影響一些關(guān)于HSCs自我更新的信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵信號(hào)對(duì)HSCs離體擴(kuò)增是非常重要的。目前來看，應(yīng)用于CB HSCs離體擴(kuò)增的小分子在許多臨床試驗(yàn)中完成了Ⅰ（Ⅱ）期，正在進(jìn)行Ⅱ（Ⅲ）期多中心臨床試驗(yàn)，初步驗(yàn)證了有效性和安全性（表2）。相信在不久的將來，HSCs體外擴(kuò)增可以建立標(biāo)準(zhǔn)化的平臺(tái)，有力推進(jìn)干細(xì)胞修飾等更多功能性研究。