趙琳 張濤 遲靜薇 李勇 王韻陽(yáng) 呂文山 王偉 王顏剛

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）是一種由胰島β細(xì)胞特異性免疫損傷引起的自身免疫疾病。肝臟作為長(zhǎng)期高血糖累及的靶器官之一，近年來(lái)其導(dǎo)致的肝損傷也逐漸得到人們的關(guān)注，有研究報(bào)道[1]，細(xì)胞因子活性可反應(yīng)肝細(xì)胞損傷的程度。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有直接或間接的抗炎、抗纖維化、抑制肝細(xì)胞凋亡和刺激肝細(xì)胞再生的作用[2-3]。因此MSCs可作為糖尿病肝損傷細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。Kakinuma等[4]體外實(shí)驗(yàn)表明，MSCs可誘導(dǎo)成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，認(rèn)為其可能具有肝臟修復(fù)功能，但是目前應(yīng)用MSCs治療糖尿病肝損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)較少。本研究采用hUCMSCs干預(yù)非肥胖糖尿?。╪o obesity diabetes，NOD）小鼠，探討其對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為糖尿病肝臟損傷的臨床治療提供新的思路。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雌性NOD小鼠，6 ～ 8 周齡，體重 20 ～ 24 g，由南京模式動(dòng)物中心提供。小鼠自由飲食飲水。

2.試劑：胎牛血清、DMEM-LG、0.05%胰酶、100× 雙 抗（美 國(guó) HyClone公 司），CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、HLA-DR 等 流 式抗體（美國(guó)BD公司），小鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；TRIzol（美國(guó) Invitrogen公司）；TRUEscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒、2×Sybr Green qPCR Mix 熒光定量檢測(cè)試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]。

二、方法

1. hUCMSCs的培養(yǎng)與鑒定：人臍帶來(lái)源于健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦足月新生兒，且經(jīng)產(chǎn)婦簽署知情同意。臍帶洗凈剪成1 mm3，經(jīng)Ⅰ型膠原酶消化后，離心洗滌，去上清液，將沉淀接種于培養(yǎng)皿，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)80%～ 90%時(shí)，用0.05%胰酶消化，按1 : 2的比例傳代。培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)符合相關(guān)細(xì)胞表型，即CD73、CD90、CD105表達(dá)為陽(yáng)性，CD34、CD45、CD14和HLA-DR表達(dá)為陰性。

2.動(dòng)物分組及干預(yù)：NOD小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，連續(xù)飼養(yǎng)8周，其中每周稱重1 次和檢測(cè)隨機(jī)血糖，測(cè)得的隨機(jī)血糖連續(xù)2次≥16.6 mmol/ L 時(shí)診斷為T1DM小鼠。將所有糖尿病小鼠隨機(jī)分組，干細(xì)胞組：發(fā)病后第3天通過(guò)尾靜脈注射hUCMSCs 1×106（0.3 ml PBS混懸）治療；糖尿病組：糖尿病發(fā)病后不采取任何干預(yù)措施。同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組：飼養(yǎng)9周后均未檢測(cè)到血糖升高的NOD小鼠。各組小鼠以發(fā)病當(dāng)天記作第0天，其中每周檢測(cè)隨機(jī)血糖水平。3個(gè)月后處死小鼠，剪下整個(gè)肝臟，分別置于4%多聚甲醛和去RNA酶的EP管（至少2份）中，以備進(jìn)行包埋切片和提RNA使用。

3. HE染色及肝損傷評(píng)估：4%多聚甲醛中取出小鼠肝臟組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片制成組織切片，行HE染色；脫蠟、脫水：將切片放在二甲苯中脫蠟15 min，后酒精由高濃度到低濃度各浸泡1 min后蒸餾水中；染色：切片置于蘇木精溶液染色數(shù)分鐘；自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇分化；自來(lái)水沖洗，稀氨水反藍(lán)；蒸餾水沖洗，伊紅染色2 ～ 3 min，自來(lái)水沖洗；脫水：將染色后的切片置于高濃度（95%）乙醇里；透明：切片經(jīng)二甲苯透明；封固：把樹膠滴到透明的切片中，附上蓋玻片并貼標(biāo)志；上鏡：光鏡下觀察皮膚組織各種結(jié)構(gòu)并統(tǒng)計(jì)差異。

4. ELISA法檢測(cè)肝臟AGEs水平：采用BC A法檢測(cè)小鼠肝臟中蛋白的含量。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μl，于37 ℃溫育2 h，棄去液體，甩干。分別加入100 μl生物素標(biāo)記抗體工作液，于37 ℃溫育1 h。棄去液體后甩干，加入200 μl洗液，靜置2 min，棄去液體后甩干，重復(fù)3次。分別向每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μl，37 ℃溫育1 h，將孔內(nèi)液體倒掉并甩干，洗板5次。按順序分別加入底物溶液 90 μl，避光，放置于 37 ℃溫箱，顯色 15 ～ 30 min。按順序分別加入終止液50 μl，終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，在5 min內(nèi)測(cè)OD值：將酶標(biāo)儀設(shè)定在450 nm波長(zhǎng)，測(cè)量各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依次計(jì)算AGEs濃度。

5.定量 PCR 法檢測(cè)肝臟 RAGE、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平：Trizol法提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以1 μl cDNA為模板。設(shè)計(jì)定量PCR引物，并委托上海生物工程有限公司合成（表1），PCR 反應(yīng) 95 ℃，5 s；60 ℃退火，30 s，40 個(gè)循環(huán)；融解 95 ℃，15 s，60 ℃，1 min。反應(yīng)結(jié)束后，記錄熒光曲線并分析計(jì)算出Ct 值，ΔCt為樣品 Ct—內(nèi)參照 Ct，取 2-Δt代表被檢樣品mRNA相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。小鼠不同時(shí)點(diǎn)血糖濃度，小鼠肝臟組織AGEs，IL-6、NF-κB p65、TNF-α 及 RAGE mRNA 表達(dá) 水 平 以x± s表示，采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.小鼠一般狀況：與正常對(duì)照組小鼠相比，糖尿病組小鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，飲水、進(jìn)食明確增多，精神萎靡，體型持續(xù)消瘦，而經(jīng)胰島素組和干細(xì)胞治療后的小鼠多飲、多尿、多食、消瘦情況較輕，皮毛脫落現(xiàn)象較少。

2.小鼠血糖水平的改變：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組小鼠各點(diǎn)血糖均升高（表2、表3，P＜0.05）；而胰島素組及干細(xì)胞治療組在治療7 d后血糖水平開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與糖尿病組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且干細(xì)胞組血糖水平較胰島素組血糖水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 Real-time qPCR引物序列

表2 小鼠不同時(shí)點(diǎn)血糖濃度（mmol/L，± s）

表2 小鼠不同時(shí)點(diǎn)血糖濃度（mmol/L，± s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與干細(xì)胞組比較，bP ＜ 0.05

分組 動(dòng)物數(shù)（只） 0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常對(duì)照組 105.93±0.676.69±1.097.05±1.697.08±0.836.76±1.72干細(xì)胞組 1023.02±1.6614.42±5.0311.15±5.689.08±2.168.84±2.51糖尿病組 1023.37±1.04a 31.66±1.68ab 33.18±0.10ab 32.78±0.68ab 32.63±0.67ab F值 696.34169.45168.54950.19640.49 P 值 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

表3 小鼠不同時(shí)點(diǎn)血糖濃度（mmol/L，± s）

表3 小鼠不同時(shí)點(diǎn)血糖濃度（mmol/L，± s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與干細(xì)胞組比較，bP ＜ 0.05

分組 動(dòng)物數(shù)（只） 35 d 42 d 49 d 56 d正常對(duì)照組 106.96±1.475.96±1.136.36±1.267.18±1.62干細(xì)胞組 107.14±1.147.20±1.087.30±1.378.46±1.37糖尿病組 1032.65±0.69ab 32.62±0.72ab 32.72±0.63ab 32.82±0.59ab F值 1671.282287.841743.241233.08 P 值 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟形態(tài)（HE染色，×200）

表4 小鼠肝臟組織 AGEs，IL-6、NF-κB p65、TNF-α 及 RAGE mRNA 表達(dá)水平（± s）

表4 小鼠肝臟組織 AGEs，IL-6、NF-κB p65、TNF-α 及 RAGE mRNA 表達(dá)水平（± s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與干細(xì)胞組比較，bP ＜ 0.05

分組 動(dòng)物數(shù)（只） AGEs（ug/ml） IL6（×10-2） NF-κB p65（×10-2） TNF-α（×10-2） RAGE（×10-2）正常對(duì)照組 100.50±0.116.19±0.367.05±0.207.81±0.310.95±0.16干細(xì)胞組 100.72±0.109.31±1.6710.08±1.9411.92±1.823.87±0.27糖尿病組 101.35±0.22ab 18.04±1.69ab 15.46±3.09ab 22.12±3.23ab 5.12±0.26ab F值 85.9192.82128.33141.23186.82 P 值 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

3.小鼠肝臟組織病理學(xué)改變（圖1）：HE染色顯示，正常對(duì)照組小鼠肝組織中肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，偶爾可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，整體為正常肝臟形態(tài)；糖尿病組小鼠肝臟HE可見肝小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞邊界不清晰，肝細(xì)胞索排列紊亂，假小葉形成，肝細(xì)胞腫脹，間質(zhì)內(nèi)可見較明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝損傷較為嚴(yán)重；干細(xì)胞組與糖尿病組小鼠相比肝細(xì)胞形態(tài)較為正常，肝細(xì)胞腫脹、肝小葉破壞及假小葉形成情況均有較明顯的改善，肝損傷程度明顯降低。

4.小鼠肝臟組織AGEs水平變化：將各組小鼠肝臟提總蛋白后檢測(cè)AGEs水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組肝臟中AGEs的表達(dá)量為（0.50±0.11）pg/ml，糖尿病組小鼠肝臟中AGEs量為（1.36±0.22） pg/ ml，兩組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3、P＜ 0.05）。干細(xì)胞組小鼠肝臟中AGEs的表達(dá)水平低于糖尿病組小鼠肝臟表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

5.小鼠肝臟組織 RAGE、NF-κB p65、IL-6 及TNF-α mRNA表達(dá)水平（q-PCR法）改變：與正常組相比，其他兩組 RAGE、p65、IL-6、TNFα mRNA 表達(dá)均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4，P＜ 0.05）；干細(xì)胞組小鼠肝臟中以上各基因mRNA表達(dá)水平均低于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

討 論

近年來(lái)，1型糖尿病發(fā)病率不斷升高[5]，嚴(yán)重影響著人類的健康。肝臟損傷是1型糖尿病重要的并發(fā)癥之一，慢性炎癥等因素是糖尿病肝損傷的主要原因[6]，但其具體的致病機(jī)制尚不十分清楚。揭示糖尿病肝損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療方法對(duì)于降低糖尿病肝臟疾病并發(fā)癥發(fā)病率，延長(zhǎng)患者生存期具有非常重要的意義。

糖尿病肝臟損傷的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，其中一個(gè)非常重要的原因便是高血糖導(dǎo)致的高糖積累。本組資料結(jié)果顯示：血糖最高的糖尿病組小鼠的肝臟損傷最為嚴(yán)重，而干細(xì)胞組由于高血糖有所緩解，肝臟損傷亦有所減輕。有研究顯示，AGE/ RAGE途徑在糖尿病肝臟損傷并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展中發(fā)揮著一定的作用[7]。另有研究表明，在糖尿病患者中，AGEs/RAGE通路的激活可以通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程改變[8]。已有研究指出，通過(guò)激活caspase-8，NF-κB和JNK途徑，可以增強(qiáng)T1DM大鼠肝臟中的TNF-α表達(dá)，這可能是導(dǎo)致肝臟凋亡細(xì)胞死亡的關(guān)鍵[9]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的P65亞基在組織炎癥損傷中過(guò)度表達(dá)[10]。NF-κB由p65、p50、IκB-α 3個(gè)亞基的異源二聚體組成，釋放的p65亞基和p50亞基可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，促進(jìn)IL-6、TNFα等炎癥介質(zhì)的釋放，加重炎癥損傷[11]。同時(shí)，AGEs與NF-κB的P65亞基結(jié)合可以導(dǎo)致RAGE表達(dá)升高，導(dǎo)致正反饋激活，進(jìn)一步增加受體表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，AGEs在糖尿病發(fā)病后表達(dá)升高；Real-time PCR結(jié)果顯示糖尿病組小鼠肝臟組織中 RAGE、p65、IL-6、TNFα mRNA 表達(dá)較正常組小鼠肝臟組織表達(dá)升高，證明AGEs/ RAGE可能參與了糖尿病肝臟損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

MSCs是細(xì)胞治療領(lǐng)域的明星分子，其免疫調(diào)節(jié)能力、自我更新和多向分化的潛能為其應(yīng)用于臨床提供了理論基礎(chǔ)。MSCs以其獨(dú)特的優(yōu)越性而在臨床應(yīng)用中更受青睞。越來(lái)越多的研究表明，MSCs能以多種方式保護(hù)糖尿病肝臟損傷，如免疫調(diào)節(jié)，控制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)等[13-15]，MSCs治療可以抑制AGEs/RAGE通路的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕由糖尿病并發(fā)的肝臟損傷[16]。本組資料MSCs組的隨機(jī)血糖明顯低于糖尿病組，可能與控制了胰島的炎癥反應(yīng)有關(guān)。MSCs組小鼠肝臟組織中各因子表達(dá)水平較糖尿病組明顯下降，這充分證明了MSCs對(duì)糖尿病肝損傷的治療意義，為糖尿病肝損傷的治療提供了新的思路。

本研究結(jié)果表明：MSCs移植能明顯改善糖尿病小鼠的高血糖狀態(tài)，改善肝臟微觀病理狀態(tài)，降低AGEs濃度及某些炎性因子的水平，從而減輕肝臟損傷，對(duì)糖尿病性肝損傷有保護(hù)作用。雖然MSCs治療目前還面臨諸多問(wèn)題，但相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MSCs終將會(huì)為1型糖尿病的治療創(chuàng)造奇跡。