陳 超，楊微波，張宏麗，李俊敏，戴 虹，張 祿 綜述，游 晶審校

（昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染性疾病科 650032）

人類免疫缺陷病毒（HIV）在病毒學(xué)上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬。目前發(fā)現(xiàn)兩種HIV，分別為人類免疫缺陷病毒－1（HIV－1）和人類免疫缺陷病毒－2（HIV－2），兩者具有相似的病毒結(jié)構(gòu)和傳播途徑。HIV－2毒力和傳播力都低于HIV－1，它引起的艾滋病（AIDS）病程也較緩和。HIV－1是目前引起全世界AIDS流行的主要病原，其感染人群占全球HIV感染者的90%以上［1］。目前HIV的研究也是以HIV－1為主進(jìn)行的。

人類免疫缺陷病毒附加蛋白Nef（HIV－1Nef）是HIV附加基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白。HIV－1NefR在從HIV感染發(fā)展到AIDS的整個(gè)進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用［2］。目前研究認(rèn)為Nef的功能主要是在下調(diào)細(xì)胞膜表面受體、干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、促進(jìn)病毒釋放、增強(qiáng)HIV的轉(zhuǎn)錄、增加病毒基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用。另外在Nef各種形式突變以及對(duì)HIV的影響方面也有不少的研究報(bào)道，在這方面有可能為HIV疫苗的設(shè)計(jì)帶來(lái)新的希望。

1 Nef概述

1.1 Nef的概念 Nef是HIV－1基因組編碼的一種多功能的輔助蛋白。它在整個(gè)病毒的復(fù)制階段持續(xù)性表達(dá)，從而在病毒復(fù)制周期的各個(gè)階段發(fā)揮重要的作用，并對(duì)HIV－1體內(nèi)的致病性以及AIDS進(jìn)展都有重要的影響。

1.2 Nef的結(jié)構(gòu) Nef是由nef基因編碼的含有206個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量為25×103～27×103的輔助蛋白。人們通過(guò)核磁共振和X晶體衍射認(rèn)識(shí)到Nef蛋白是由6個(gè)α螺旋、1個(gè)β折疊及5個(gè)β型反平行的單鏈組成。N端aa6～22形成一個(gè)規(guī)則的α螺旋；核心區(qū)域有折疊完好的結(jié)構(gòu)，aa69～78為富含脯氨酸的序列，可形成Ⅱ型聚脯氨酸螺旋，其中SH3結(jié)構(gòu)域（aa70～77）是酪氨酸蛋白激酶（Src）家族的主要結(jié)合位點(diǎn)；SH3結(jié)構(gòu)域后面是2個(gè)α螺旋（81～120，αA和αB）、1個(gè)四股反向平行的β片層（aa121～186，βA～βD）以及另外2個(gè)α螺旋（aa187～203，αC和αD）；aa60～71及aa149～180形成暴露的，可溶性彈性環(huán)狀結(jié)構(gòu)；3個(gè)鄰近的螺旋（aa70～120）形成一個(gè)容易結(jié)合藥物的空穴，可阻斷Nef與Src激酶家族間相互作用［3］。

2 HIV－1NefR與細(xì)胞膜表面相關(guān)受體的作用

目前研究表明，HIV－1Nef可以通過(guò)對(duì)CD4、人類組織主要相容性復(fù)合體－1（MHC－1）類分子等細(xì)胞膜表面分子的下調(diào)擾亂機(jī)體內(nèi)免疫平衡，降低免疫細(xì)胞的功能。

2.1 與CD4分子受體的作用 CD4分子是由55×103的Ⅰ型細(xì)胞表面糖蛋白組成的MHC－2限制性細(xì)胞表面T細(xì)胞受體［4］，如輔助T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及可以作為HIV或猴免疫缺陷病毒（SIV）的主要細(xì)胞受體。

HIV－1感染細(xì)胞的過(guò)程首先是 HIV－1的糖蛋白120（gp120）與宿主細(xì)胞第一受體（CD4分子）結(jié)合，然后與其第二受體（CXCR4或CCR5）結(jié)合，從而使gp120構(gòu)象改變與糖蛋白41（gp41）分離，HIV與宿主細(xì)胞膜融合進(jìn)入細(xì)胞。因此，CD4分子是HIV病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的第一受體，下調(diào)宿主細(xì)胞CD4分子可以預(yù)防病毒包膜被宿主細(xì)胞CD4分子隔離而影響病毒顆粒的裝配，從而增加病毒顆粒的釋放。下調(diào)宿主細(xì)胞表面的CD4分子還可以預(yù)防宿主細(xì)胞的二重感染，從而減少宿主細(xì)胞的過(guò)早死亡［4］。目前認(rèn)為，HIV－1Nef主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面CD4分子的內(nèi)吞作用和阻礙細(xì)胞膜受體的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)下調(diào)細(xì)胞表面的CD4分子［5］。

Chauduri等［2］通過(guò)RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)Nef下調(diào)CD4受體過(guò)程中需要接頭蛋白（AP）或AP的相關(guān)蛋白參與。CD4蛋白細(xì)胞質(zhì)尾部近膜區(qū)域有雙亮氨酸殘基，正常情況下該位點(diǎn)與Src激酶家族的p56Lck結(jié)合后被封閉，阻止AP介導(dǎo)的內(nèi)化［7］。Nef WL（57～58）和核心區(qū) G95、L97、R106及 L110殘基直接結(jié)合CD4細(xì)胞質(zhì)區(qū)雙亮氨酸基序，磷酸化其細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)Ser408，導(dǎo)致CD4被內(nèi)吞［6］。最近有報(bào)道稱應(yīng)用酵母三向雜交法顯示:Nef與AP1、AP3有相互作用，而與AP2和AP4之間沒有相互作用［6］。據(jù)觀察分析在Nef與AP1和AP3的μ亞基之間有很強(qiáng)的相互作用參與反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（TGN）和內(nèi)體性溶酶體之間的運(yùn)輸［6］。最近研究發(fā)現(xiàn)，HIV Nef蛋白在下調(diào)細(xì)胞表面CD4分子過(guò)程中除了依賴AP外，同時(shí)還依賴于泛素化賴氨酸殘基K144［7］。在另外一些調(diào)節(jié)蛋白，如液泡ATP激酶亞基VIH對(duì)Nef介導(dǎo)的細(xì)胞表面CD4分子的下調(diào)也起到一定的作用［8］。VIH是AP包裹小泡的一部分，對(duì)于體內(nèi)溶酶體的酸化是必需的。酵母雙向雜交顯示，Nef的C末端柔韌環(huán)與V1H結(jié)合，同時(shí)V1H也具有AP－2μ2鏈的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)AP2將CD4與AP連接［9］。另外也有研究表明，Nef可以使CD4受體分子通過(guò)多泡體通路，將其運(yùn)輸至溶酶體，從而使CD4受體分子在溶酶體內(nèi)被降解［10］。

2.2 與CD28分子受體的作用 CD28表達(dá)于外周血中幾乎所有CD4陽(yáng)性T細(xì)胞和50%的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞表面。此外，漿細(xì)胞和部分活化B細(xì)胞也表達(dá)CD28。其配體是表達(dá)于B細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞（APC）表面的B7家族分子。CD28與B7家族構(gòu)成了活化T細(xì)胞的重要的第二信號(hào)。Nef對(duì)CD28的下調(diào)可以使T細(xì)胞的激活受到抑制，但具體對(duì)病毒的意義還不十分清楚，有可能促進(jìn)感染HIV－1的T細(xì)胞從APC釋放，加速感染HIV－1的T細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)，從而加強(qiáng)病毒的傳播。目前認(rèn)為Nef對(duì)CD28的下調(diào)主要是靠AP－2在CD28和Nef之間相互作用完成的［11］。Nef的這種活性現(xiàn)象存在于多個(gè)保守的HIV－1和SIV病毒株中。165和166位雙亮氨基酸（LL165／166）殘基和194位組氨酸（His194）殘基為 Nef下調(diào)CD28起了關(guān)鍵作用［12］。

2.3 與MHC分子的作用 MHC分子即為主要組織相容性復(fù)合體，可以分為 MHC－1和 MHC－2兩種類型。其主要生物學(xué)功能是通過(guò)提呈抗原而激活T細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Nef對(duì)MHC分子的下調(diào)可以使被病毒感染的宿主細(xì)胞逃脫細(xì)胞毒性T細(xì)胞即TCL細(xì)胞的攻擊，這對(duì)HIV感染宿主細(xì)胞以及發(fā)展成為AIDS都具有至關(guān)重要的作用。這也是病毒逃逸免疫機(jī)制的經(jīng)典途徑之一。但目前Nef對(duì)MHC分子的下調(diào)機(jī)制仍不十分清楚。

2.3.1 與 MHC－1分子的作用 Nef對(duì) MHC－1分子的作用并不是影響MHC－1的合成以及其在細(xì)胞內(nèi)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的運(yùn)輸，但可以通過(guò)阻礙MHC－1分子高爾基體運(yùn)輸至細(xì)胞表面從而導(dǎo)致MHC－1分子在高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的蓄積。也可通過(guò)加速細(xì)胞膜表面已經(jīng)表達(dá)的成熟 MHC－1分子的內(nèi)吞作用和加速對(duì)其反向運(yùn)輸至反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。普遍認(rèn)為，二磷酸腺酐（ADP）糖基化因子Arf6可以促進(jìn)細(xì)胞表面MHC－1的下調(diào)，其機(jī)制可能為Nef與酸弗林蛋白酶酸性氨基酸族分選蛋白－1（PACS－1）結(jié)合啟動(dòng)ADP糖基化因子（Arf6）的內(nèi)吞途徑，從而下調(diào)細(xì)胞表面MHC－1分子至反面高爾基網(wǎng)。而Arf6介導(dǎo)的內(nèi)吞作用主要是通過(guò)GTP／GDP與Arf6的結(jié)合狀態(tài)來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)的，在此過(guò)程中還受到Nef蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域連接的PxxP和 Met20的控制［13］。Larsen等［14］通過(guò)抑制Arf6上游活化劑磷酸肌醇三磷酸激酶發(fā)現(xiàn)并不能影響細(xì)胞表面 MHC－1分子的內(nèi)吞過(guò)程。但是Arf6的活性有助于使內(nèi)吞的MHC－1類分子轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基網(wǎng)。因此，認(rèn)為Nef介導(dǎo) MHC－1類分子的下調(diào)機(jī)制明顯依賴于Arf6是由于其活性的降低可以非特異性干擾細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。另外，通過(guò)消除Nef蛋白N末端豆蔻?；慕Y(jié)構(gòu)將完全廢止MHC－1和CD4分子的下調(diào)，從而保護(hù)CTL細(xì)胞、T輔助細(xì)胞及B細(xì)胞表位［15］。說(shuō)明Nef的豆蔻?；瑯邮谴龠M(jìn)MHC－1下調(diào)的重要結(jié)構(gòu)。Nef下調(diào)MHC－1的機(jī)制有助于受染CD4陽(yáng)性細(xì)胞躲避CTL裂解的作用［16］，從而利于促成病毒庫(kù)和潛伏性感染。Jimmy和Jung［17］通過(guò)運(yùn)用一種小分子抑制劑2C干擾Nef與Scr家族激酶之間相互作用，成功抑制了被HIV感染的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞表面MHC分子的下調(diào)。這有可能為治療和控制AIDS探索出新的方法。

2.3.2 與MHC－2分子的作用 MHC分子主要通過(guò)提呈抗原肽而激活T細(xì)胞，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。其中MHC－2類分子主要參與CD4陽(yáng)性Th細(xì)胞的外源性識(shí)別。MHC－2存在于所有能被HIV感染的細(xì)胞類型當(dāng)中。

Nef對(duì)MHC－2分子抗原提呈的干擾作用主要通過(guò)兩種不同機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，其機(jī)制包括了下調(diào)細(xì)胞表面表達(dá)的成熟MHC－2分子和上調(diào) MHC－2相關(guān)不變側(cè)鏈在細(xì)胞膜上的表達(dá)。MHC－2相關(guān)不變側(cè)鏈?zhǔn)荕HC－2對(duì)抗原處理過(guò)程中相關(guān)的伴侶蛋白，其作用是抑制抗原肽與 MHC－2的結(jié)合以及增強(qiáng)MHC－2分子的折疊［18］。因此Nef通過(guò)增強(qiáng) MHC－2的不變鏈在細(xì)胞膜上的表達(dá)從而減弱MHC－2的抗原提呈作用。在此過(guò)程中，Nef與AP連接模體的雙氨基酸區(qū)域LL165／166以及AP與MHC－2分子細(xì)胞質(zhì)尾部連接區(qū)域的部分雙亮氨酸殘基DDQRDL1（8）和 EQLPML（17）對(duì) Nef上調(diào)細(xì)胞表面 MHC－2分子不變側(cè)鏈起到了十分關(guān)鍵的作用［19］。此外，Nef對(duì)MHC－2不變側(cè)鏈的上調(diào)依賴Nef中等水平量的表達(dá)，因此在長(zhǎng)期非進(jìn)展性患者體內(nèi)不會(huì)使MHC－2不變側(cè)鏈表達(dá)的上調(diào)［20］。Nef除了上調(diào) MHC－2不變側(cè)鏈外還可以下調(diào)細(xì)胞表面成熟的MHC－2分子，其機(jī)制目前認(rèn)為并不是通過(guò)通常的內(nèi)吞途徑實(shí)現(xiàn)的，但是其具體機(jī)制還不十分明確［21］。深入研究Nef對(duì)細(xì)胞表面分子的下調(diào)機(jī)制，尤其是針對(duì)Nef與表面分子結(jié)合位點(diǎn)的抑制性研究可為治療HIV－1感染提供新的理論依據(jù)［22］。

3 HIV－1NefR增強(qiáng)病毒的感染性

目前有研究已證實(shí)了HIV－1的Nef可以增加HIV的感染性并促進(jìn)HIV的釋放［23］。Nef可以增強(qiáng)病毒從脂質(zhì)筏出芽的方式來(lái)增強(qiáng)病毒的感染性。有研究發(fā)現(xiàn)，HIV病毒包膜含有豐富的神經(jīng)節(jié)苷脂，正是胞膜脂質(zhì)筏的主要組成元件，其功能與增強(qiáng)HIV的感染性有直接的相關(guān)性［24］。另外有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)力蛋白2（Dyn2）是細(xì)胞內(nèi)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。它能與Nef的輔助蛋白共同作用增加病毒的感染性。用小RNA干擾抑制Dyn2或者敲除Dyn2基因?qū)⒆璧KHIV－1的感染［25］。說(shuō)明Dyn2在Nef增強(qiáng)HIV感染的過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

Bergonizini等［26］通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期的非進(jìn)展性HIV－1感染患者體內(nèi)Nef有自然消除的現(xiàn)象。經(jīng)進(jìn)一步的研究證明，消除Nef可以減弱HIV－1的感染能力，但其機(jī)制還不是十分清楚?？赡芘cNef參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及宿主細(xì)胞蛋白激酶的相互作用有關(guān)。

目前，在艾滋病相關(guān)性腦病方面的研究表明，HIV Nef蛋白在其發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用［26］。當(dāng)外周單核巨噬細(xì)胞被HIV感染后，可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織當(dāng)中，進(jìn)而感染腦組織中固有單核巨噬細(xì)胞，從而引起其釋放各種炎性因子，引起相應(yīng)的臨床癥狀。HIV Nef能通過(guò)促進(jìn)被感染的單核巨噬細(xì)胞釋放各種炎性介質(zhì)及腫瘤壞死因子（TNF）的表達(dá)［27］，而在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。

4 HIV－1NefR與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的作用

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞可識(shí)別與之接觸的細(xì)胞所呈遞的信號(hào)，或者識(shí)別周圍環(huán)境中存在的各種化學(xué)和物理信號(hào)，并通過(guò)受體將這些信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生各種信息分子和有規(guī)律的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而改變細(xì)胞內(nèi)的某些代謝過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這種針對(duì)外源信息所發(fā)生的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的全過(guò)程稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在人體免疫系統(tǒng)中，尤其是T細(xì)胞在識(shí)別外源性抗原并被激活的過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到了至關(guān)重要的作用。

與T細(xì)胞結(jié)合抗原及其被激活過(guò)程密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子主要有Src家族、ZAP70家族和Tec家族。其中Src家族中Fyn主要與T細(xì)胞抗原受體結(jié)合存在，Lck主要與輔助受體CD4／CD8結(jié)合存在。當(dāng)T細(xì)胞抗原受體接受抗原刺激活化時(shí)，兩者均可以發(fā)生酪氨酸磷酸化并得以活化，再作用于下游底物分子使之磷酸化。ZAP70可以與T淋巴細(xì)胞的抗原受體的ξ亞單位相結(jié)合的70×103的蛋白。T細(xì)胞受體的酪氨酸被磷酸化后，可以結(jié)合ZAP70使之活化。Tec家族也是一類重要的蛋白酪氨酸激酶，它們?cè)诩?xì)胞的發(fā)育和活化過(guò)程中是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，但具體功能還不十分清楚。

Nef缺乏任何催化活性，但其在宿主細(xì)胞內(nèi)可以起到影響激酶以及其他一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用［29］。分子質(zhì)量分別為62×103和72×103的雙磷酸蛋白被稱為Nef相關(guān)激酶（NAKs）。其中一種蛋白是P21活性激酶（PAK2），可以直接影響細(xì)胞骨架形態(tài)和細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡信號(hào)［30］。Nef可以影響PAK2調(diào)節(jié)由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞信號(hào)分子以及誘導(dǎo)改變細(xì)胞骨架和細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄中的作用。另外Nef還可以通過(guò)誘導(dǎo)感染以及未被感染的免疫細(xì)胞表達(dá)Fas及其配體FasL從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞特別是HIV特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTLs）的凋亡，從而使HIV獲得免疫逃逸。

5 HIV－1NefR在預(yù)防和治療作用中的展望

Nef通過(guò)下調(diào)細(xì)胞表面CD4和CCR5等受體分子以及MHC－1和成熟的 MHC－2類分子來(lái)逃脫宿主免疫攻擊、促進(jìn)病毒釋放、增強(qiáng)病毒感染性等眾多生物學(xué)功能。其在AIDS的發(fā)病機(jī)制以及從HIV感染發(fā)展成為AIDS的過(guò)程中起著重要的作用。正因?yàn)槠潢P(guān)鍵作用為人們預(yù)防HIV感染和治療AIDS找到新的希望。

Balog和Minarovits［31］通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期非進(jìn)展性HIV感染者的研究發(fā)現(xiàn)Nef剔除的HIV或者是高度變異后出現(xiàn)基因組缺陷的HIV（dHIV）能夠干擾野生型HIV的復(fù)制。因此人們可以通過(guò)人工處理的dHIV注射入HIV感染者的體內(nèi)能夠減緩發(fā)展成為AIDS的進(jìn)程甚至有可能起到治療AIDS的作用。目前，在疫苗研究方面還沒有找到可很好預(yù)防HIV感染的疫苗，其主要障礙是HIV缺乏固有的和獲得性的保護(hù)性免疫能力［32］。不過(guò)近年針對(duì)Nef疫苗的研究也有很多成果。Erfle等［33］發(fā)現(xiàn)，在病毒的V2區(qū)域刪除外膜蛋白后可以抑制Nef的產(chǎn)生和釋放，由此可能為Nef的免疫疫苗找到新的方法。

由于對(duì)Nef在細(xì)胞內(nèi)的具體作用過(guò)程認(rèn)識(shí)還不十分清楚，限制了針對(duì)Nef這一潛在的靶點(diǎn)治療和預(yù)防手段的發(fā)展。隨著對(duì)Nef研究的不斷深入，必將為人類預(yù)防HIV感染，治療AIDS提供更多更好的途徑和方法。

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