郭 亮，蔡海林，何命軍，謝鵬飛，張萬良，梁棋政

（1.湖南省煙草公司長沙市公司，湖南 長沙 410011；2.長沙市煙草公司寧鄉(xiāng)縣分公司，湖南 長沙 410600）

煙草病毒病俗稱煙草花葉病，是煙草生產(chǎn)上的嚴重病害。煙草感染煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）后，葉片葉綠素被破壞，光合作用減弱，生長受抑制，造成植株生長困難，畸形、矮化，甚至導致死亡。由于病毒粒子是活體寄生，侵入寄主后，其核酸很快與寄主的核糖體結(jié)合，與寄主的代謝融為一體，不僅與寄主爭奪營養(yǎng)成分，還破壞其寄主的相關(guān)組織細胞，借助寄主的代謝來復制病毒自身的蛋白，改變某些代謝平衡和一些酶的活性。煙草病毒病防治較為困難，導致煙草減產(chǎn)幅度為20%～80%，全球每年煙草花葉病毒造成的損失可達1億美元[1]。大多病毒對抗生素等藥物不敏感，且目前很難找到既抑制病毒又不損傷寄主的藥物，因此煙草病毒病的防治就成為困擾植物保護界的一大難題[2]。

植物體內(nèi)含有豐富的生物活性物質(zhì)，其次生代謝產(chǎn)物超過40萬種，大多數(shù)物質(zhì)，如菇烯類、生物堿、類黃酮、酚類、氨基酸和多糖等均具有一定的殺蟲抑菌作用。據(jù)相關(guān)報道，植物源抗病毒物質(zhì)的篩選主要集中在抗TMV方面[3]，目前已試驗的有591種植物提取物對真菌或細菌有拮抗作用，173種植物提取物具有抗病毒作用[4]。該研究對植物源活性天然抑制劑的篩選方法和作用機理進行了初步綜述，并對其存在的問題和發(fā)展前景進行了討論。

1 植物源抗煙草花葉病毒活性抑制劑的篩選方法

目前常用的植物病毒抑制劑的篩選方法是枯斑半葉法和酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）。近年來科研工作者不斷完善植物病毒抑制劑的篩選方法，以避免藥物在抑制病毒的同時對植株寄主本身造成傷害。1996年江山等[5]研究發(fā)現(xiàn)，病毒在裝配過程中，病毒衣殼蛋白要先形成一定程度的多聚體，之后才能與病毒核酸進一步裝配，形成完整的病毒粒體。運用這一理論，發(fā)現(xiàn)了對TMV衣殼蛋白聚合作用的影響程度可以作為植物內(nèi)源抗病毒物質(zhì)的篩選方法之一。1997年李重九等[6]提出建立離體核酸核糖體反應(yīng)體系，通過對病毒RNA與寄主mRNA競爭核糖體的系數(shù)來篩選藥劑，實驗證明離體核酸核糖體反應(yīng)體系可以作為篩選植物病毒抑制劑的方法之一。2000年侯玉霞等[7]提出病毒/細胞高效同步侵染體系，運用該體系研究了3種植物源提取物抗TMV的活性測定和對葉綠體的保護作用。通過對不同抗病毒物質(zhì)進行篩選，并進行整株實驗和大田實驗，證明了病毒/細胞高效同步侵染體系在篩選植物病毒抑制劑方面具有可行性。

2 植物源活性物質(zhì)抗TMV等植物病毒的作用機理

煙草病毒具有生命周期，包括吸附、侵染、增殖、擴散、裝配和釋放等過程。從理論上講，只要阻斷或限制煙草病毒生命周期中的某一環(huán)節(jié)，或者生命周期中參與的主要因子，就可以達到抑制病毒的效果。目前抗植物病毒的主要機理包括抑制病毒的侵染、病毒增殖和擴散、病毒癥狀的表達和誘導植物產(chǎn)生抗性等。

2.1 抑制病毒的侵染

通過抑制TMV對寄主的侵染是目前植物源病毒抑制物發(fā)揮作用的主要途徑，這種抑制病毒侵染的作用方式一般有兩種，一種是直接鈍化病毒阻止其侵染，另一種是通過體外抑制直接或間接占據(jù)病毒侵染位點。

研究表明多數(shù)植物病毒抑制物是通過直接作用來抑制病毒的，將病毒暫時性或永久性地鈍化。如國內(nèi)廣泛使用的植物抗病毒劑NS-83，就是通過在體外鈍化TMV的活性來達到抑制TMV侵染的目的，它同時可以抑制病毒的增殖作用[8-9]。此外，還有些植物病毒抑制物通過破壞病毒的完整性來達到抑制病毒侵染的作用，比如萬壽菊素和槲皮素，與TMV結(jié)合會引起病毒粒體形態(tài)改變，從而使病毒的侵染活性下降[10]。

病毒侵染植物，在寄主植物上必需有特定的識別位點，這些位點一般存在于植物寄主葉片上，阻止病毒與這些位點的結(jié)合，也是抑制病毒侵染的主要途徑之一。如硫脈基磷酞胺脂類化合物，可以吸附TMV病毒顆粒，使其不能與寄主植物上識別位點結(jié)合，從而達到抗病毒的效果；商陸中提取的蛋白質(zhì)PAP，與TMV結(jié)合可以降低TMV的侵染活性；雞冠花提取物可以抑制TMV形成枯斑，通過與病毒結(jié)合，使其無法發(fā)揮吸附作用[11-12]。此外，還有一些生物堿或黃酮類化合物，也可以通過鈍化病毒或占據(jù)病毒侵染位點來達到抑制TMV侵染的作用。

2.2 抑制病毒增殖和擴散

在病毒侵染寄主植物后，病毒就能在寄主體內(nèi)進行增殖和擴散，這是個一系列的過程，包括脫殼、病毒核酸復制、蛋白質(zhì)合成、病毒裝配和擴散轉(zhuǎn)移（體內(nèi)長距離運動）等環(huán)節(jié)?？梢葬槍@些環(huán)節(jié)中的某個或某些環(huán)節(jié)來抑制病毒增殖或擴散，從而達到防治病毒病的目的。

現(xiàn)有的抗TMV的植物病毒抑制物有作用于抑制病毒的復制，如紫草提取蛋白PZ1，它的作用機制是抑制TMV-RNA合成和TMV-RNA與核糖體的結(jié)合，減弱病毒RNA與寄主RNA競爭核糖體的機會，使原本與核糖體結(jié)合能力大大超過寄主RNA的病毒RNA選擇性的受到抑制，同時增強寄主mRNA的結(jié)合能力，從而抑制病毒核酸的復制和蛋白質(zhì)的合成。有部分植物病毒抑制物對病毒RNA復制及蛋白質(zhì)的表達進行抑制或干擾，通過這種途徑來抑制病毒的增殖，如植物RIPs，就是使真核細胞核糖體失活來抑制病毒復制。也有植物病毒抑制物通過抑制或干擾病毒粒子的裝配過程，使病毒粒子不能完整的裝配，從而達到抑制病毒增殖的效果[13]。如商陸中提取的蛋白PAP，可以抑制TMV病毒衣殼蛋白合成，從而影響病毒粒子的裝配。植物抗病毒抑制劑VFB、WCT-II以及大蒜揮發(fā)油等通過干擾TMV外殼蛋白的聚合，發(fā)揮抑制病毒增殖的功能[14-15]。

此外，一些植物源的小分子物質(zhì)也可以通過抑制病毒的增殖來發(fā)揮抗TMV的作用[16-17]。

2.3 抑制病毒癥狀的表達

在煙草花葉病毒侵染寄主植物，增殖和擴散后，就要在寄主植物上進行表達，而這種表達在宏觀上看就是在植物上所表現(xiàn)的癥狀。一般來說，在病毒進行侵染、增殖后，會破壞植物細胞，特別是其中的葉綠體和葉綠素，使寄主植物表現(xiàn)出花葉、褪綠、壞死等癥狀。有些植物病毒抑制物從病毒癥狀的表達上來抑制病毒的危害，使植株健康生長，如N-（2-苯并咪唑基）氨基甲酸甲脂，通過影響寄主植物激素含量或維持葉綠體含量來消除病害癥狀的發(fā)生，抑制病毒癥狀的表達。有些激素也可以抑制病毒癥狀的產(chǎn)生。如施用赤霉素來增加植株的產(chǎn)量，在TMV病毒含量不減少的情況下可以減輕癥狀，從而抵消病毒對產(chǎn)量帶來的不利影響[18]。李玉霞等報道一些植物病毒抑制劑夠抑制TMV對寄主植物葉綠體的作用，其作用機理可能是花葉癥狀嚴重程度與TMV外殼蛋白濃度正相關(guān)，在葉綠體中，葉綠體與TMV外殼蛋白結(jié)合會打斷光合作用中的電子傳遞鏈，這些病毒抑制劑通過抑制TMV對葉綠體的破壞，促進寄主植物的光合作用。

2.4 誘導植物產(chǎn)生抗性

隨著現(xiàn)代生物學的發(fā)展，以及各種檢測技術(shù)的進步，利用植物抑制物誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)、穩(wěn)定、持久的抗病性，這將成為植物病理學研究的方向之一。對煙草的誘導抗性研究起步較早，以TMV為研究對象，已經(jīng)形成了相對比較系統(tǒng)的理論。一般來說，在病毒侵染寄主植物后，植株本身會感受到病毒的存在，并通過內(nèi)源信號分子產(chǎn)生抗病毒信號，傳遞至整株植物，進而激活寄主植物潛在的抗病基因，使植物發(fā)生一系列細胞學和生物學變化，激活和誘導寄主植物系統(tǒng)抗性，抑制病毒侵染。

目前研究比較多的植物內(nèi)源信號分子為茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid SA）和乙烯（ethylene，Et）等[19-20]。關(guān)于誘導產(chǎn)生的抗病毒物質(zhì)，報道的主要有病程相關(guān)蛋白（PRs蛋白）、抗病毒因子（Anti-virusfactor，AVF）、水楊酸或過氧化物酶等。誘導植物合成PRs的原理是植物病毒抑制劑激發(fā)苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，將游離狀態(tài)的苯丙氨酸相繼轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸、香豆素、植保素、木質(zhì)素、單寧等，同時誘發(fā)合成相關(guān)酶和蛋白，參與抗病過程，起到防衛(wèi)反應(yīng)的作用。在TMV侵染下，一些抗病毒的物質(zhì)能誘導寄主植物中產(chǎn)生抗病毒因子，一般為含磷糖蛋白，具有抗病毒能力。除了一些植物源蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)以外，一些小分子物質(zhì)也可以作為病毒抗性誘導劑，如生物堿、萘醛、甾體、脂肪酸等[21-22]。

3 植物源抗病毒抑制劑在研究應(yīng)用中存在的問題及前景

目前，在植物源抗病毒抑制劑的研究方面取得了一些進展，但也存在一些問題，主要集中在這幾個方面：一是篩選出的植物病毒抑制劑在抑制病毒的同時，也對寄主植物本身產(chǎn)生毒害作用。如目前廣泛使用的廣譜抗植物病毒劑——病毒唑，它對一些主要的植物病毒都有一定程度的防治效果，但對寄主植物本身也有不同程度的毒害作用。二是植物源抗病毒抑制劑的作用時間和范圍有限。至今已篩選出的植物源病毒抑制劑，大部分在植物組織的局部施藥都有一定的效果，但是作用的有效期短，不抗雨水沖刷，其中起作用的主要成分是堿基類似物或其前體類似物。三是植物源抗病毒抑制劑大多成分復雜，各成分在抗病體系中起到了不同的抑制作用，一般具有良好的病毒抑制效果，但易受環(huán)境因素影響，常導致藥效不穩(wěn)定。四是沒有建立一個簡便、快速、完整的藥劑篩選及檢測體系，篩選方法還有待進一步完善。

煙草病毒病發(fā)生日趨嚴重，抗病毒藥劑的研發(fā)和使用對于防治該病具有重要意義。目前，傳統(tǒng)的抗病毒制劑往往效果不佳，或者對植物有毒害作用。運用基因工程技術(shù)開發(fā)轉(zhuǎn)基因抗病品種，如弱毒疫苗、衛(wèi)星核酸等又存在一定爭議，不容易被采納。植物源活性物質(zhì)抗病毒效果良好，其治療效果不亞于化學合成制劑，且資源豐富、綠色環(huán)保，在環(huán)境中一般不易降解，不會造成環(huán)境污染和殘留毒性問題，具有廣闊的發(fā)展前景。

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