孫 哲 ，余 鋒 ，衣玉麗 ，章 潔 ，汪小浪

（南昌大學(xué)a.第一附屬醫(yī)院腫瘤科；b.護(hù)理學(xué)院；c.醫(yī)學(xué)院生化教研室，南昌 330006）

在選用培美曲塞作為晚期肺腺癌患者的化療方案時(shí)先檢測(cè)患者外周血胸苷酸合成酶（TS）mRNA表達(dá)的情況來(lái)預(yù)測(cè)培美曲塞給患者帶來(lái)的益處，能更加有針對(duì)性的選用化療方案，從而進(jìn)行個(gè)體化治療。檢測(cè)患者外周血TS mRNA的表達(dá)比檢測(cè)腫瘤組織中TS表達(dá)更方便易行。本文應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）檢測(cè)晚期肺腺癌患者化療前TS mRNA水平并分析其與培美曲塞治療療效的關(guān)系,以探討其在預(yù)測(cè)晚期肺腺癌化療療效方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇 2009年 6月至 2011年12月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的Ⅲ、Ⅳ期晚期肺腺癌患者29例。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡＜70歲；體力狀況（ECOG）評(píng)分＜2分；經(jīng)組織病理學(xué)確診為腺癌；根據(jù)UICC肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)為Ⅲ期或Ⅳ期；未接受過(guò)手術(shù)、放化療和靶向治療;有可測(cè)量病灶；肝腎功能正常，無(wú)化療禁忌，且預(yù)計(jì)生存期大于3個(gè)月；取得患者及家屬同意。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol（Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工），引物由primer premier5.0軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)，TS引物序列:5’2 CTTCAGCGAGAACCCAGACC23’，5’2 TCCAGCCCAACCCCTAAAGAC23’，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度192 bp。

1.3 化療方案

培美曲塞 500 mg·m-2靜脈點(diǎn)滴，第1天;順鉑75 mg·m-2靜脈點(diǎn)滴，第1天。21 d為1周期。用藥前 24 h口服地塞米松 4 mg，2次·d-1，連服 3 d；用藥前1周給予VitB121000 μg單次肌內(nèi)注射，并予葉酸 400 μg，1 次·d-1，連服至培美曲塞結(jié)束后 21 d。

1.4 療效評(píng)價(jià)

化療2周期后按RECIST1.1實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效。有效組為完全緩解（CR）和部分緩解（PR），無(wú)效組為穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展者（PD）。

1.5 外周血TS mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用RT-PCR檢測(cè)患者化療前外周血中TS mRNA的表達(dá)水平。對(duì)所有的肺癌患者于治療前抽取外周靜脈血5 mL,EDTA抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液分離出白細(xì)胞。按照Trizol Reagent說(shuō)明提取外周血的總RNA，-70℃保存，備用。RNA-cDNA特異序列逆轉(zhuǎn)錄:30 ℃ 10 min，42 ℃ 35 min，99 ℃ 5 min，4℃5 min；瞬間離心5～10 s。PCR特異序列擴(kuò)增:PCR 反應(yīng)體系 25 μL，其中 cDNA 2 μL，10×PCR 緩沖液 4 μL，TaqDNA 聚合酶（1 U·μL-1）1 μL，4 種dNTP 混合物（2 mmol·L-1）2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，上下游引物各 0.04 μL，用無(wú) RNA 酶去離子水定容至25 μL。以三磷酸甘油醛脫氫酶（glycer-aldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)對(duì)照，與目的基因同管擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min后，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s），4℃冷卻，同時(shí)cDNA在同一反應(yīng)條件下，用GAPDH上下游內(nèi)引物各10 μL，同樣條件30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物分析:用1.5%的瓊脂糖凝膠，厚度約4 mm，上樣擴(kuò)增產(chǎn)物 10 μL，每 cm 電壓為 80 V，電泳 30 min，在SZD700凝膠成像系統(tǒng)下攝像分析。并計(jì)算目的片段的灰度，分別與其內(nèi)參GAPDH的灰度作比較分析（TS/GAPDH）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

化療2周期后，根據(jù)化療療效分組，29例中有效組 7例（CR 1例，PR 6例），無(wú)效組 22例（SD 16例，PD 6例）。有效組外周血 TS mRNA的表達(dá)為0.66±0.12，無(wú)效組為 1.23±0.21，有效組明顯低于無(wú)效組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

培美曲塞（pemetrexed，MTA，LY231514）是基于經(jīng)典的抗代謝類藥物甲氨蝶呤和氟尿嘧啶基礎(chǔ)上研制的新一代抗代謝藥，由禮來(lái)公司（EliLily，Inc）研發(fā)。除FDA批準(zhǔn)的適應(yīng)證:惡性胸膜間皮瘤和非小細(xì)胞肺癌外，培美曲塞單藥或聯(lián)合化療對(duì)多種腫瘤有明顯的治療作用。培美曲塞能夠通過(guò)干擾葉酸代謝和DNA的合成來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。培美曲塞的作用靶點(diǎn)在于嘧啶和嘌呤合成過(guò)程中的多種酶。其中之一是作用于TS，此作用與氟尿嘧啶（FU）類似，TS是胸苷酸合成中的限速酶，在DNA合成中充當(dāng)著關(guān)鍵作用，由于對(duì)TS的抑制，故DNA合成所必須的可利用的胸腺嘧啶減少，接著就造成細(xì)胞增殖下降，特別是在快速增殖的腫瘤細(xì)胞［1］。

有4項(xiàng)培美曲塞與鉑類藥物聯(lián)合一線治療晚期NSCLC的Ⅱ期臨床研究［2-5］結(jié)果表明，培美曲塞與鉑類聯(lián)合方案的療效與其他常用的含鉑兩藥聯(lián)合方案相似，而毒性反應(yīng)的發(fā)生率則明顯較低。

化療在癌癥的治療中占重要地位，然而化療并非對(duì)所有的癌癥患者都有效，如何使癌癥化療更具針對(duì)性、有效性、減少盲目性，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。有很多研究證明肺腺癌中TS呈顯著的高表達(dá)［6］，TS對(duì)肺癌的預(yù)后同樣非常有意義。非小細(xì)胞肺癌的惡性程度也同TS的高表達(dá)有關(guān)［7-8］。既往研究表明，腫瘤內(nèi)TS水平的高低能夠預(yù)測(cè)TS相關(guān)治療的療效［9］。那么外周血TS mRNA的表達(dá)水平能不能預(yù)測(cè)培美曲塞的療效？本研究的結(jié)果顯示:臨床有效（CR+PR）的患者外周血TS mRNA表達(dá)水平低于穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD）的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，晚期肺腺癌外周血中TS轉(zhuǎn)錄水平對(duì)培美曲塞治療療效的預(yù)測(cè)有一定的價(jià)值。

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