馬潔華，霍艷麗，羅靜娜綜述，張 輝審校

（1.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 張家口075000 2.河北省張家口市婦幼保健院，河北 張家口075000）

皮膚是機(jī)體與外界環(huán)境接觸的屏障，具有抵御外界微生物入侵、代謝、調(diào)節(jié)體溫等重要作用.皮膚缺損的修復(fù)是外科領(lǐng)域的一個(gè)基本問題，不僅需要?jiǎng)?chuàng)面及時(shí)和永久的覆蓋而且要能最大限度地恢復(fù)功能和外觀.目前常用的修復(fù)方法—自體皮移植、同種異體皮移植和異種皮移植，都存在著供區(qū)不足、免疫排斥和傳播疾病等缺陷.因此，尋找一種理想的皮膚替代物成了一個(gè)亟需解決的難題［1］.

組織工程是一門新興的邊緣學(xué)科，它是利用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，研究開發(fā)用于修復(fù)、維持和改善損傷組織結(jié)構(gòu)和功能的生物替代物的一門學(xué)科［2］.組織工程皮膚是將種子細(xì)胞與適當(dāng)?shù)闹Ъ懿牧舷嘟Y(jié)合，構(gòu)建出用于修復(fù)、維護(hù)和改善損傷皮膚組織功能和形態(tài)的生物替代物.近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，先后研制出了不同類型的組織工程皮膚替代物［3］，應(yīng)用組織工程皮膚及時(shí)覆蓋創(chuàng)面、減少創(chuàng)面收縮、瘢痕增生及恢復(fù)外觀是解決大面積燒傷皮膚缺損的最根本途徑，因而組織工程皮膚的研究臨床意義重大.

種子細(xì)胞是組織工程的基本要素，因此，種子細(xì)胞的選擇成為當(dāng)前組織工程皮膚研究的關(guān)鍵.研究較多的種子細(xì)胞主要是自體細(xì)胞和干細(xì)胞，自體細(xì)胞雖然是攜帶全部基因組型的理想種子細(xì)胞，但自體取材損傷大，體外擴(kuò)增能力有限，對(duì)大面積嚴(yán)重皮膚缺損，靠自體取材難以實(shí)現(xiàn)皮膚的再生.而干細(xì)胞的全能和無限增殖性使其在皮膚組織工程中成為首選，從理論上講，用單一的干細(xì)胞就能夠克隆出含多種細(xì)胞的復(fù)雜的立體的皮膚組織［4］，胚胎干細(xì)胞由于具有一定的免疫原性并且受倫理學(xué)的限制，目前研究?jī)A向于成體干細(xì)胞.現(xiàn)在骨髓干細(xì)胞 （bone marrow stem cells，BMSCs）的體外誘導(dǎo)技術(shù)較為成熟，但其來源少、數(shù)量有限［5］，限制了其廣泛應(yīng)用.自從2001年Zhk［6－7］等從脂肪抽吸物中成功分離出脂肪干細(xì)胞 （adipose derived stem cell，ADSCs）以來，ADSCs的研究成為繼BMSCs之后又一熱點(diǎn).ADSCs具有來源豐富、方便取材、低免疫原性、體外擴(kuò)增條件低等優(yōu)點(diǎn)，它將成為今后組織工程皮膚理想的種子細(xì)胞.現(xiàn)就ADSCs的分離、識(shí)別及其研究進(jìn)展作一綜述.

1 ADSCs的概念和來源

Zuk等［6－7］以吸脂方式獲得的人脂肪組織為研究對(duì)象，按照Katz等［8］的干細(xì)胞分離方法，消化離心后簡(jiǎn)單處理脂肪組織，獲得一個(gè)顯微鏡下呈成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群，體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群具有穩(wěn)定的倍增效應(yīng)和低衰老性，與BMSCs相似，因此稱之為ADSCs.ADSCs與BMSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞衰老、多向分化能力以及基因轉(zhuǎn)染效率無顯著差異，但ADSCs原代培養(yǎng)中紅細(xì)胞參雜比例不會(huì)隨著組織量的增加而大幅增加［9］.管利東［10－11］等證實(shí)了ADSCs在不同誘導(dǎo)方案下能夠分化為脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌和心肌細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及造血細(xì)胞等組織細(xì)胞［12－18］.

提取ADSCs的脂肪組織主要來源于外科手術(shù)切取和抽脂術(shù)廢棄的脂肪，從脂肪組織中分離細(xì)胞的方法最早由Rodbell報(bào)道，Zuk等［6－7］實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADSCs的存在.對(duì)如何獲得純度高、增殖活性強(qiáng)的ADSCs，研究者在年齡、取材部位、培養(yǎng)條件和傳代次數(shù)等方面做了大量研究，Schipper等［19］發(fā)現(xiàn)ADSCs在人前臂脂肪組織中含量更多.目前微載體技術(shù)和旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的聯(lián)合應(yīng)用為ADSCs的大規(guī)模擴(kuò)增提供了更加有效的途徑［20－21］.

2 ADSCs的生物學(xué)特性及鑒定

2.1 ADSCs的形態(tài)

原代培養(yǎng)ADSCs接種時(shí)，培養(yǎng)物中混有大量紅細(xì)胞，隨著換液次數(shù)的增多紅細(xì)胞被清除.接種后24 h內(nèi)基本完成貼壁，72 h后細(xì)胞完全伸展，貼壁細(xì)胞開始分裂增殖，呈兩種形態(tài)：一種為梭形成纖維細(xì)胞樣，兩端有較長(zhǎng)的突足；另一種為扁平不規(guī)則或多角形，突起較大.1周后細(xì)胞融合，排列出現(xiàn)方向性，呈 “漩渦狀”.傳代后細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，以梭形細(xì)胞為主.電鏡觀察顯示，ADSCs早期呈成纖維細(xì)胞樣，胞核大，含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng).

2.2 ADSCs的分離

目前應(yīng)用最廣泛的ADSCs分離純化方法是膠原酶消化法［22－23］.利用分子表型進(jìn)行分離比較困難，因?yàn)锳DSCs無特異性的分子標(biāo)志.目前，ADSCs分離純化的另一個(gè)新線索是通過免疫化學(xué)方法檢測(cè)ADSCs中的CD44、HLA－DR和Ⅷ因子.ADSCs的獲得量和分化能力受一些因素影響，如取材部位、年齡等.通常供者年齡越小，ADSCs的增殖能力越強(qiáng)，腹部脂肪獲得的ADSCs不易凋亡［24－25］，脂肪抽吸術(shù)一般不影響ADSCs的活性，但超聲輔助條件下獲得的ADSCs增殖能力降低［26］.

2.3 ADSCs的表型及鑒別

目前尚無簡(jiǎn)便快速鑒定ADSCs的方法，ADSCs在形態(tài)上與BMSCs相似，因此無法從形態(tài)學(xué)上與之鑒別［27］.ADSCs與BMSCs共同表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD90、CD105等，但前者表達(dá)CD49d，不表達(dá)CD106，而后者恰恰相反［28］.對(duì)ADSCs免疫表型的鑒定研究者做了大量工作，但結(jié)果卻不盡相同.如Gr ont hos等發(fā)現(xiàn)ADSCs表達(dá)CD34，不表達(dá)STRO－1，而Likewise和Zuk則得到相反的結(jié)果［29－30］，這可能與檢測(cè)所用的細(xì)胞代數(shù)、分離方法及使用的單克隆抗體不同等有關(guān).干細(xì)胞與分化成熟細(xì)胞的不同之處在于細(xì)胞表面抗原表達(dá)不同，更重要的是前者具有多向分化的能力.因此鑒定ADSCs最好的方法是進(jìn)行多系定向誘導(dǎo)，免疫組化染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型的結(jié)果可起輔助作用.現(xiàn)在大多數(shù)試驗(yàn)研究中鑒定ADSCs常運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中的CD49d、CD44、CD106.

3 ADSCs向表皮細(xì)胞分化的研究

目前文獻(xiàn)報(bào)道的ADSCs體外誘導(dǎo)向表皮細(xì)胞分化的研究報(bào)道還很少［31］.當(dāng)前運(yùn)用較多的方案是條件培養(yǎng)基加表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （basic fibroblast growth factor，b FGF）或者HaCa T細(xì)胞，鑒定上大多數(shù)實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)CK19以及CK5／8、CK1、CK10／13來證實(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)物為表皮細(xì)胞.雷永紅等［31］用含30%大鼠皮膚勻漿液的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSCs，3 d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表達(dá)CK19、CK14的陽性率較對(duì)照組明顯升高.Martin等［32］用全反式維甲酸 （ATRA）、地塞米松、ITS、尼克酰胺、牛血清白蛋白、葡萄糖鳥氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺等作為條件培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化.王先成等［33］在有EGF及維甲酸等成分的誘導(dǎo)培養(yǎng)基下，使ADSCs轉(zhuǎn)化為類角質(zhì)細(xì)胞.Thomas［34］等將ADSCs在流式細(xì)胞儀中分選純化并標(biāo)記，注入皮膚缺損的裸鼠體內(nèi)，1周后在皮膚原缺損處可檢測(cè)到標(biāo)記的ADSCs，表明ADSCs在體內(nèi)可向表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化.以上結(jié)果提示，ADSCs在特定的誘導(dǎo)條件下有早期向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的潛能［35－36］.

4 ADSCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合的研究

ADSCs可通過分泌多種生長(zhǎng)因子，如VEGF、PLGF、TGF－β和HGF等，以促進(jìn)創(chuàng)傷部位血管再生及重建［37］；還能通過旁分泌作用于成纖維細(xì)胞，使其分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白，促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞的成熟［38］，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合和瘢痕縮小.

5 結(jié) 語

隨著對(duì)ADSCs認(rèn)識(shí)的深入，促進(jìn)、支持其生長(zhǎng)分化成熟的各種生物因子，模擬體內(nèi)微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)等研究均將取得重大突破，為ADSCs成為組織工程皮膚研究的理想種子細(xì)胞，并最終用于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的臨床治療提供前提和保障.為臨床上解決嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積燒傷病人的皮膚來源緊張問題和促進(jìn)難愈創(chuàng)面的修復(fù)等問題提供良好的解決方法.

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