蘇美燕

(萊陽慧農(nóng)養(yǎng)殖服務(wù)有限公司 山東 萊陽 265200)

0 引言

仿刺參（Apostichopus japonicus）又稱灰刺參、刺參，是海參中質(zhì)量最好的一種，被譽為“參中之冠”，主要分布于我國的遼寧、山東和河北沿海，主產(chǎn)于煙臺、威海、長山島、大連等地。自20 世紀50 年代以來國內(nèi)逐漸開展了刺參人工育苗及增養(yǎng)殖技術(shù)研究工作，相繼開展了刺參人工育苗生產(chǎn)，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，現(xiàn)在每年生產(chǎn)的刺參商品苗已突破億枚，甚至高達數(shù)十億枚，居世界首位。

同時，刺參養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展和不規(guī)范運作也造成了病害問題日趨突出，出現(xiàn)了多種明顯病癥和大規(guī)模死亡現(xiàn)象，部分養(yǎng)殖區(qū)相繼發(fā)生了很多疾病。 苗種培育的成敗是決定仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)量的重要因素。有關(guān)海參疾病的研究,國內(nèi)外報道多屬疾病的調(diào)查范疇。 本文對刺參育苗期爛邊病及其致病源進行分析，以期為刺參病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

患病耳狀幼體取自山東蓬萊某發(fā)病仿刺參育苗池，經(jīng)鏡檢有明顯的爛邊癥狀，體長650－700μm。 以虹吸法抽取適量發(fā)病育苗池池水至消毒塑料瓶，水中含患病幼體約1 萬只，充氣，人工感染用健康幼體采自山東蓬萊一仿刺參育苗場，體長650μm－700μm。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

細菌分離用培養(yǎng)基TSA 和TCBS 均購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；ID32E 細菌鑒定系統(tǒng)試驗條購自生物梅里埃中國有限公司；抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病參的顯微鏡檢

以無菌燒杯取發(fā)病池水，靜置5min，吸取燒杯底部池水置顯微鏡下觀察，選取其中典型的爛邊耳狀幼體，制作水浸片逐一鏡檢，初步觀察記錄幼體病變情況。

1.3 病原的分離純化

以300 目無菌篩絹過濾池水得到患病幼體， 用無菌海水充分洗滌，并收集于Eppendorf 管，將患病幼體離心(2800×g，5min)富集后，以無菌研缽充分研磨。在無菌條件下，用接種環(huán)挑取研磨后得到的樣品，在TSA 和TCBS 固體培養(yǎng)基上劃線分離；將平板置于28℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，38h 后挑取優(yōu)勢菌落，連續(xù)進行4 次純化培養(yǎng)得到優(yōu)勢菌。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)觀察純培養(yǎng)的細菌于28℃培養(yǎng)24h 后，進行革蘭氏染色和光鏡觀察。

1.5 人工回接感染

1.5.1 菌懸液的制備

用接種環(huán)將分離所得優(yōu)勢菌接種于液體培養(yǎng)基中放在培養(yǎng)箱（28℃160-180r/min）中振蕩培養(yǎng)24h，取出離心(4000×g，5min)得到菌泥，用1.5%的滅菌生理鹽水將所得優(yōu)勢菌制成懸液，并用麥式比濁法確定濃度。

1.5.2 浸浴法人工回接感染

將12 個2L 的燒杯置于盛有20L 自來水的塑料水箱（底部設(shè)置加熱棒）內(nèi)，燒杯內(nèi)底部放置一塊圓形波紋板(面積同燒杯的底面，緊貼燒杯內(nèi)壁)，注入無菌海水1L，調(diào)節(jié)整個系統(tǒng)溫度于19－22℃。 在各燒杯內(nèi)投放健康耳狀幼體，使其終密度為1.1cells/mL。 各感染組燒杯中加入菌懸液， 使細菌終濃度分別為1.0×104cells/mL、1.0×105cells/mL、1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL 和1.0×108cells/mL，空白對照組不加細菌。 各感染組和對照組均設(shè)2 個平行。 實驗期間投喂新月菱形藻和紅酵母，投喂量為2.5×104cells/mL;每天換水1 次，換水量為1/2(感染組需補充細菌，維持感染濃度);整個實驗光強控制在1300lx 左右。 每隔5h鏡檢幼體情況， 并從感染后出現(xiàn)癥狀的幼體中再次分離優(yōu)勢細菌，進行形態(tài)及生理生化指標分析（方法同前）。

1.6 藥敏試驗

選用生產(chǎn)中常用藥物，采用紙片法進行藥敏測試；用麥式比濁法配制濃度大于1×109cells/mL 的菌懸液約1mL， 吸取100μL 均勻涂布于TSB 培養(yǎng)基上，貼上藥敏試紙，于28℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24h，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，判斷藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病幼體癥狀觀察、病原初檢和優(yōu)勢菌分離

經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)：患“爛邊癥”的耳狀幼體失去浮游能力、活力下降，體表邊緣發(fā)黑、粗糙并出現(xiàn)不同程度的潰爛，嚴重者發(fā)生解體、自溶。 在患病個體潰爛組織處均發(fā)現(xiàn)大量活躍的細菌，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲、霉菌等其它病原，由此可初步確定細菌是主要病原。 分離得到1 種優(yōu)勢菌株記為RES-1。 RES-1 在TSA 培養(yǎng)基上的菌落為圓形,邊緣光滑,濕潤不透明,呈微黃。 并在TCBS 培養(yǎng)基上生長良好且使培養(yǎng)基變成黃色。

2.2 細菌學鑒定結(jié)果

細菌RES-1(從病參分離)、RES-2(從人工感染病參分離)均呈革蘭氏陰性，短桿狀略有彎曲。

2.3 人工回接感染結(jié)果

優(yōu)勢菌RES-1 對健康仿刺參幼體的浸浴感染實驗結(jié)果見表1。 5個感染組均出現(xiàn)“爛邊”癥狀，出現(xiàn)時間分別為實驗開始后的第30、25、20、10 和5h。觀察比較25h 和50h 內(nèi)刺參狀況發(fā)現(xiàn)：隨著感染時間的延長，各感染組燒杯水層中健康幼體逐漸減少并開始下沉，而燒杯底部幼體檢出數(shù)逐漸增多(除了1.0×108和1.0×107感染組因細菌劑量高幼體已發(fā)生解體、 自溶， 故50h 時燒杯底部上的幼體檢出數(shù)少于25h 時)。 通過鏡檢發(fā)現(xiàn)各感染組幼體均出現(xiàn)規(guī)律性的病變:感染初期幼體活力下降，浮游能力降低，繼而體表外周明顯加厚、顏色發(fā)黑;有的幼體胃部發(fā)黑萎縮，停止攝食，體壁腫大并崩解;隨著感染時間的推移，幼體發(fā)生溶解并最終解體、死亡；而對照組幼體未發(fā)生爛邊癥狀。從出現(xiàn)“爛邊”癥狀的幼體中再次分離病原，得到優(yōu)勢菌RES-2，對其進行形態(tài)學及生理生化分析，結(jié)果與RES-1 完全一致，結(jié)果符合科赫法則。

2.4 藥敏實驗結(jié)果

菌株RES-1 對生產(chǎn)中常用的抗菌藥物的敏感性檢測見表2。 菌RES-1 對少數(shù)抗生素，包括鏈霉素、四環(huán)素、利福平、青霉素G、強力霉素不敏感，對其它受試抗菌藥物較敏感。

3 討論

目前，中國仿刺參養(yǎng)殖技術(shù)從人工育苗到成參的養(yǎng)殖和人工增殖均處于世界領(lǐng)先水平，仿刺參養(yǎng)殖經(jīng)濟效益高，市場發(fā)展空間巨大，已成為我國北方海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)。 隨著海參業(yè)的迅猛發(fā)展，出現(xiàn)了技術(shù)落后和病害等一系列問題，長期以來有關(guān)仿刺參的研究主要集中在繁殖生物學、育苗技術(shù)、養(yǎng)殖生態(tài)以及藥用活性物質(zhì)等，對近幾年來養(yǎng)殖及育苗中出現(xiàn)的各種病害只有簡單外在的描述，并未進行較深入系統(tǒng)的研究。 中國仿刺參養(yǎng)殖主要集中在山東和遼寧沿海地區(qū)，也是海參各種疾病流行較廣泛的地區(qū)，包括腐皮綜合征、爛邊癥、爛胃病、化板癥、細菌性潰爛病、盾纖毛蟲病、霉菌病、扁形動物病和后口蟲病等，嚴重制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。而近幾年在遼寧、山東等地仿刺參浮游期幼體時期較廣泛流行的疾病是“爛邊癥”。 該病具有流行性廣、死亡率高等特性。王印庚等首先對浮游期幼體的“爛邊癥”進行了病原學研究。 發(fā)現(xiàn)該病是有弧菌屬細菌引起，該菌是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要病原之一，也是引發(fā)海參疾病的主要病原。山東長島、膠南等地育苗場均有該病發(fā)生，死亡率達70%以上，可見其危害相當嚴重，鑒于此本文對該爛邊癥的病原及其致病來源作了再次的分析。通過培養(yǎng)基培養(yǎng)分離出優(yōu)勢菌株，將分離的優(yōu)勢菌株進行人工回接感染，結(jié)果符合科赫法則，因此最終確定了“爛邊癥”的病原。進一步從形態(tài)學、生理生化方面對病原進行分析，將其鑒定為弧菌屬燦爛弧菌。在本研究中，對水產(chǎn)生產(chǎn)中常用的抗生素進行了敏感性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病原菌對一些抗生素具有抗藥性，而對大多數(shù)受試藥物敏感，這些藥物均可考慮在生產(chǎn)中用于該病的防治。因此，在本研究的基礎(chǔ)上，我們建議在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，為了避免爛邊癥的發(fā)生，一方面，應(yīng)杜絕病原菌進入養(yǎng)殖系統(tǒng)，進一步嚴格進行餌料質(zhì)量檢測和凈化育苗水體，包括水源水、親參育苗系統(tǒng)等;另一方面，在進行藥物防治時，藥物選擇必須對病原有針對性，切忌濫用抗生素。

表2 菌株RES-1 的藥敏實驗結(jié)果