王志會，錢林學，劉 冬

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050)

1 前言

硼中子俘獲治療(boron neutron capture therapy，BNCT)是一種安全、有效的二元化治療腫瘤的方法[1]。BNCT通過腫瘤細胞內(nèi)的核反應來摧毀癌細胞，通過口服或注射對乏氧腫瘤細胞和分裂間期細胞具有強親和力的攜帶劑10B，以中子射線對其進行照射，中子與10B結(jié)合后發(fā)生核反應，釋放出具有短程殺傷作用的α粒子和7Li粒子，從而殺死癌細胞[2]。在國外，該項技術(shù)在治療惡性腦膠質(zhì)瘤[3，4]、皮膚惡性黑色素瘤[5]等方面已經(jīng)取得了令人鼓舞的成果。將BNCT成功應用于其他腫瘤治療的核心問題是如何使得含10B的藥物有選擇性地在腫瘤組織內(nèi)積聚。

脂質(zhì)體是靶向給藥系統(tǒng)的一種新劑型，具有被動靶向性、緩釋性，組織親和性以及低毒性等特點，是一種很好的藥物靶向運載工具[6]。葉酸受體大部分來源于上皮組織的惡性腫瘤，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和鼻咽癌細胞中均有高度表達[7]。目前常用的硼攜帶劑是巰基十二硼烷二鈉鹽(BSH)和對二羥基硼酰苯丙氨酸(BPA)，且已有報道將BSH和BPA制備成脂質(zhì)體[8]，但其包封率均較低，不足20%。本實驗旨制備葉酸靶向的含硼脂質(zhì)體，并對其制備處方和工藝條件進行了篩選和優(yōu)化，為BNCT的研究與應用提供一個有效的靶向給藥途徑。

2 儀器及試劑

實驗用到的儀器如下:AE200分析天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)，UV—2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)，LC—10A高效液相色譜儀(日本島津公司);AgilentHC—C18色譜 C18柱(5 μm ，250 mm × 4.6 mm)(日本島津公司)，XW—80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)，RE—52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海振捷實驗設備有限公司)，GL—802A微型臺式真空泵(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，PHS—3D型pH計(上海精科)，Nano—ZS納米粒度及zeta電位分析儀(馬爾文，英國)，SK1200H超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)，TGL—16G臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠)。

實驗用到的試劑如下:Folic acid－PEG－DSPE(F－PEG－DSPE，Nanocs);氫化大豆卵磷脂(HSPC，Avanti);膽固醇(Chol，Avanti);三氯甲烷(北京化工廠)，經(jīng)CaH2回流、蒸餾干燥;葡聚糖凝膠G—25(Solarbio);4—羥基苯硼酸(HBA，北京普瑞東方化學技術(shù)有限公司)脂質(zhì)體、2—噻吩硼酸(TBA，北京普瑞東方化學技術(shù)有限公司)脂質(zhì)體;4—叔丁基苯硼酸(BBA，北京普瑞東方化學技術(shù)有限公司);甲醇(色譜純，DIKMA)。

3 方法及結(jié)果

3.1 HBA靶向脂質(zhì)體的制備

采用復乳法制備HBA靶向脂質(zhì)體，精確稱取不同量的Folic acid－PEG－DSPE、磷脂、膽固醇置于茄形瓶中，加入適量三氯甲烷，使其完全溶解。將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，室溫下進行真空減壓去除有機溶劑，使瓶壁上形成一層均勻的薄膜，然后加入一定量HBA溶液水化，渦旋振蕩數(shù)分鐘，轉(zhuǎn)入超聲波乳化器。超聲一段時間后，再次將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，室溫下進行真空減壓，即制得較均勻的HBA靶向脂質(zhì)體懸浮液。采用聚碳酸酯膜進行擠壓，膜的孔徑分別為 0.8、0.4、0.2 μm，測平均粒徑為(135±10)nm，置于4℃保存。

3.2 TBA、BBA靶向脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備TBA、BBA靶向脂質(zhì)體，精確稱取不同量的Folic acid－PEG－DSPE、磷脂、膽固醇與TBA或BBA置于茄形瓶中，加入適量三氯甲烷，使其完全溶解。將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，室溫下進行真空減壓去除有機溶劑，使瓶壁上形成一層均勻的薄膜，然后加入一定量磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液水化，渦旋振蕩數(shù)分鐘，轉(zhuǎn)入超聲波乳化器，超聲一段時間即制得較均勻TBA或BBA靶向脂質(zhì)體懸浮液。采用聚碳酸酯膜進行擠壓，膜的孔徑分別為 0.8、0.4、0.2 μm，測平均粒徑分別為(109±4)nm、(127±6)nm，置于4℃保存。

3.3 HBA、TBA、BBA最大吸收波長的測定

采用紫外分光光度法確定HBA、TBA、BBA的最大吸收波長。精密吸取1 mg/mL的HBA、TBA、BBA溶液 1 mL，定容至 50 mL，配成濃度為20 μg/m L的 HBA、TBA、BBA 溶液，置于石英吸收池中，以其溶劑為空白對照，在190～400 nm的波長范圍內(nèi)測定最大吸收波長，得出最大吸收波長分別為234、238、225 nm，如圖1 ～3 所示。

圖1 紫外分光光度法測定HBA的吸收曲線Fig.1 The absorption curve of HBA determinated by UV spectrophotometer

圖2 紫外分光光度法測定TBA的吸收曲線Fig.2 The absorption curve of TBA determinated by UV spectrophotometer

3.4 HBA、TBA、BBA 色譜條件的選擇

HBA含量測定高效液相色譜(HPLC)法的色譜條件選擇如下:色譜柱AgilentHC—C18，甲醇∶水=20∶80 為流動相，流速為 1.0 mL/min，紫外波長為234 nm，柱溫為28℃，進樣量為20 μL。在選定的色譜條件下，以HBA計算理論塔板數(shù)為5350，符合中國藥典高效液相色譜分析方法的要求。

圖3 紫外分光光度法測定BBA的吸收曲線Fig.3 The absorption curve of BBA determinated by UV spectrophotometer

TBA含量測定HPLC法的色譜條件選擇如下:色譜柱 AgilentHC—C18，甲醇∶水 =40∶60為流動相，流速為1.0 mL/min，紫外波長為238 nm，柱溫為28℃，進樣量為20 μL。在選定的色譜條件下，以TBA計算理論塔板數(shù)為2581，符合中國藥典高效液相色譜分析方法的要求。

BBA含量測定HPLC法的色譜條件選擇如下:色譜柱為AgilentHC—C18，甲醇∶水=78∶22為流動相，流速為1.0 mL/min，紫外波長為225 nm，柱溫為28℃，進樣量為20 μL。在選定的色譜條件下，以BBA計算理論塔板數(shù)為3315，符合中國藥典高效液相色譜分析方法的要求。

3.5 HBA、TBA、BBA 標準曲線的繪制

精確稱取 HBA對照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取對照品溶液1.0 mL，分別置于5、10、25、50、100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，每次進樣20 μL，記錄數(shù)據(jù)。以峰面積(A)為縱坐標，以濃度(C，1 μg/mL)為橫坐標，進行回歸計算，回歸方程為A=96060C －3310.6，相關(guān)系數(shù) r=0.9999。結(jié)果表明，HBA在1～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

精確稱取TBA、BBA對照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取對照品溶液1.0 mL，分別置5、10、25、50、100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，每次進樣20 μL，記錄數(shù)據(jù)。以峰面積(A)為縱坐標，以濃度(C，1 μg/mL)為橫坐標，進行回歸計算，回歸方程分別A=108018C －158413、A=86782C –20512，相關(guān)系數(shù)分別為 r=0.9983、r=0.9998。結(jié)果表明，TBA、BBA在1～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.6 含量的測定

精密吸取水化后 HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體0.5 mL，置于 5 mL 離心管(EP)管中，加入 0.1 mL triton—10破乳，搖勻，作為供試液;并配制濃度為10 μg/mL的 HBA、TBA、BBA 作為對照品溶液，按外標法計算出供試品中 HBA、TBA、BBA的含量。取上述溶液各20 μL進行分析，記錄數(shù)據(jù)。含量按下式計算:含量/(%)=脂質(zhì)體中藥物的量/總藥量。

3.7 包封率的測定

用高速離心法分離脂質(zhì)體與游離藥物。精密吸取 HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體混懸液0.5 mL，置于塑料小管中，8000 r/min高速離心20 min，取上清液進樣測定，即得0.5 mL脂質(zhì)體混懸液中游離藥物(W游)。

精密吸取水化后 HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體0.5 mL，置于5 mL EP 管中，加入 0.1 mL triton—10破乳，搖勻，取樣測定，即得0.5 mL脂質(zhì)體混懸液中總藥物量(W總)。包封率 =(W總－W游)/W總×100%，測得HBA、TBA、BBA脂質(zhì)體的包封率，見表1。

表1 同藥脂比的脂質(zhì)體(n=3)的平均含量及包封率Table 1 The average content and entrapment efficiency of liposomes with different drug to lipid ratio(n=3)

4 結(jié)語

實驗的目的是制備具有良好靶向性且包封率高的含硼脂質(zhì)體，用于BNCT研究。磷脂分子形成脂質(zhì)體時，兩條疏水鏈指向雙分子層內(nèi)部，脂溶性藥物可存在于其中;親水基團在膜的內(nèi)外兩個表面上，磷脂雙分子層構(gòu)成一個封閉的小室，小室中水溶液被磷脂雙分子層包圍而獨立，其中可容納水溶性藥物。這里所采用的含硼化合物 BBA，其分子量為178.12，具有良好的脂溶性，在將其制成脂質(zhì)體的過程中，BBA可存在于磷脂雙分子層內(nèi)部，獲得較高的包封率。徐梁[9]等將H103BO3和籠狀物(Et4N)102BH10分別包入脂質(zhì)體，成功制備了胃癌免疫脂質(zhì)體，為胃癌的硼中子俘獲治療提供了有效的治療途徑。脂質(zhì)體作為藥物載體的應用雖然具備了許多優(yōu)點，但也存在一定的局限性，對于某些水溶性藥物包封率較低，藥物易從脂質(zhì)體中滲漏，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差，均是脂質(zhì)體工業(yè)化生產(chǎn)過程中亟待解決的問題。

許多腫瘤細胞(如乳腺癌細胞)的細胞膜表面都有一種特殊的蛋白質(zhì)過度表達，這種蛋白質(zhì)可特異地識別、結(jié)合葉酸，被稱為葉酸受體 (folate receptor，F(xiàn)R)。通過受體—配體特異性識別并結(jié)合，葉酸—藥物載體通過內(nèi)吞作用進入到這些腫瘤細胞，從而增強藥物的靶向性[10]。將BBA制備成葉酸靶向脂質(zhì)體，但仍需進一步研究葉酸高表達的MCF—7細胞對該靶向脂質(zhì)體的攝取、內(nèi)化及脂質(zhì)體在細胞內(nèi)的滯留與分布實驗。

實驗成功制備了靶向硼脂質(zhì)體，BBA葉酸靶向脂質(zhì)體的包封率高達94%，為BNCT治療乳腺癌提供了一種靶向給藥途徑。

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