史美龍

（吉林省人民醫(yī)院 基本外科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

靶向干擾Survivin基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞PTTG蛋白的影響

史美龍

（吉林省人民醫(yī)院 基本外科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

目的 探討重組載體介導(dǎo)的Survivin小干擾RNA（siRNA）對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo中PTTG蛋白的影響。方法運(yùn)用靶向Survivin siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞，western blot檢測(cè)PTTG蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果Survivin基因沉默后24－72h，與正常對(duì)照組相比，Survivin和PTTG蛋白表達(dá)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論Survivin基因沉默后結(jié)直腸癌細(xì)胞PTTG蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示Survivin和PTTG可能相互促進(jìn)共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

結(jié)直腸癌；免疫印跡；RNA干擾；垂體瘤轉(zhuǎn)化基因

（ChinJLabDiagn，2012，16：1174）

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率位居惡性腫瘤的第四位，且呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，盡管可以采取積極手術(shù)治療，但絕大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，其死亡率高居第三位。因此，探索新的更為有效的輔助防治方法就顯得尤為必要。本課題前期利用pGenesil-2真核表達(dá)載體構(gòu)建了靶向干擾Survivin的重組載體，發(fā)現(xiàn)Survivin基因沉默可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，提示下調(diào)Survivin基因表達(dá)有望作為結(jié)直腸癌治療新的分子 靶 點(diǎn)［1，2］。 為 明 確 其 作 用 機(jī) 制，本 研 究 運(yùn) 用Wstern blot檢測(cè)Survivin基因沉默后垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（PTTG）的表達(dá)，旨在為闡明Survivin在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及基因治療的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建與抽提

將本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGenesil-2-control（非同源干擾序列插入 pGenesil-2）和 pGenesil-2-Survivin 1（插入靶向Survivin基因5’-GGACCACCG CATCTCTACA-3’目的片段干擾序列的pGenesil-2干擾載體）以及pGenesil-2-Survivin 2（插入靶向Survivin基因 5’-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3’目的片段干擾序列的pGenesil-2干擾載體）接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37℃、250r／min振搖培養(yǎng)16h。運(yùn)用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒DNA（購(gòu)自Promega公司），按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中運(yùn)用含10%胎牛血清培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室保存的Lovo細(xì)胞株。將細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度約為5×105個(gè)／孔。運(yùn)用脂質(zhì)體 Lipo 2000 轉(zhuǎn) 染 重 組 質(zhì) 粒 pGenesil-2-control、pGenesil-2-Survivin 1和 pGenesil-2-Survivin 2，轉(zhuǎn)染方法按照Lipo2000說明書（Invitrogen公司）進(jìn)行。

1.3 Western blot檢測(cè)Survivin和PTTG蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染0h、24h、48h和72h后，收集各組細(xì)胞（正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-2-control組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-2-Survivin 1組和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-2-Survivin 2組），煮沸法裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。取20μg蛋白進(jìn)行SDSPAGE，電泳后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2h，加入第一抗體（1∶1 000兔抗人Survivin抗體，1∶200兔抗人PTTG抗體，1∶500兔抗人β-actin抗體），室溫孵育1h，4℃孵育4h，PBST洗膜3次后加入1∶1 000稀釋的兔抗鼠第二抗體孵育1h，PBST洗膜后，ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并測(cè)定平均光強(qiáng)度值（Average density value，ADV）。將目的蛋白 ADV／β-actin ADV 作為蛋白表達(dá)的相對(duì)值，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

重 組 質(zhì) 粒 pGenesil-2-control、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin2轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞后，Survivin和PTTG蛋白表達(dá)情況分別見表1、表2。Survivin基因沉默后24－72h，與正常對(duì)照組相比，Survivin蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明干擾效果可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。Survivin基因沉默后24－72h后，PTTG蛋白表達(dá)較相同時(shí)間點(diǎn)顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。圖1顯示Survivin基因沉默后24h后，Survivin和PTTG蛋白表達(dá)情況。

表1 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間Survivin蛋白表達(dá)變化

表2 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間PTTG蛋白表達(dá)變化

圖1 轉(zhuǎn)染后24h各組蛋白表達(dá)

3 討論

Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子家族中的一個(gè)新成員，具有明顯的細(xì)胞周期特異性和組織分布特征，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和凋亡。G2／M期細(xì)胞特異性高表達(dá)Survivin，若過表達(dá)超越細(xì)胞自身的周期調(diào)控時(shí)，就會(huì)引發(fā)腫瘤；相反，Survivin基因缺失的細(xì)胞又無法進(jìn)行正常細(xì)胞分裂［3］。結(jié)直腸癌中Survivin表達(dá)明顯增高，并且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，預(yù)示著結(jié)直腸癌生存期縮短和預(yù)后不良［4，5］。

近年來，應(yīng)用反義寡核苷酸靶向抑制survivin表達(dá)用于結(jié)直腸癌的治療取得了一定進(jìn)展。Mesri等報(bào)道survivin反義寡核苷酸可消除血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)抗腫瘤壞死因子或神經(jīng)酰氨誘導(dǎo)的凋亡作用，促使caspase-3活化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和毛細(xì)血管迅速退化［6］。宮向前等運(yùn)用接種人結(jié)直腸癌細(xì)胞至裸鼠皮下的方法制作結(jié)直腸癌種植瘤模型，分別用survivin反義寡核苷酸、正義核苷酸和生理鹽水進(jìn)行皮下瘤體內(nèi)注射治療，發(fā)現(xiàn)survivin反義寡核苷酸可以抑制結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)［7］。王群等運(yùn)用脂質(zhì)體將survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株Lovo細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)survivin反義寡核苷酸能增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［8］。提示survivin有望成為新的潛在靶點(diǎn)用于結(jié)直腸癌的治療。

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（PTTG）自1997年從大鼠垂體腺瘤細(xì)胞中分離以來即得到了廣泛專注。大量研究報(bào)道了其與腫瘤的相關(guān)性，包括結(jié)直腸癌，鄭建云等運(yùn)用免疫組化檢測(cè)了63例結(jié)直腸癌、癌旁及正常組織中PTTG的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTTG在癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于癌旁和非癌組織，并且在中、低分化結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)明顯強(qiáng)于高分化結(jié)直腸癌［9］。運(yùn)用siRNA靶向干擾PTTG表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，增加細(xì)胞凋亡［10］。提示PTTG可以作為臨床判斷結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為的分子生物學(xué)指標(biāo)。

關(guān)于survivin和PTTG的關(guān)系，有研究報(bào)道兩者在胃癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均高表達(dá)，相關(guān)性分析顯示兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示survivin和PTTG可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用，兩者存在共同的激活機(jī)制，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞凋亡的多種途徑［11，12］。本研究利用前期已經(jīng)構(gòu)建成功的重組載體靶向干擾結(jié)直腸癌細(xì)胞Survivin基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Survivin低表達(dá)后24－72hPTTG蛋白含量顯著下調(diào)，表明Survivin可能與PTTG相互作用共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，然而，兩者相互聯(lián)系的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

［1］史美龍.Survivin特異性shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及評(píng)價(jià) ［J］.中國(guó)老年性雜志，2009，29（11）：1352.

［2］史美龍.Survivin基因小干擾RNA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 ［J］.中國(guó)老年性雜志，2009，29（14）：1733.

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［8］王 群，李國(guó)華，楊建輝，等.Survivin反義寡核苷酸增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［J］.世界腫瘤雜志，2002，1（2）：129.

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The expression of PTTG following survivin gene silencing in colorectal cancer

SHIMei-long.（People’sHospitalofJilinProvince，Jilin130021，China）

ObjectiveTo explore the expression of PTTG following survivin gene silencing in colorectal cancer cell line Lovo.MethodsThe survivin siRNA expression vector and empty expression vector were transfected into Lovo cells by liposome 2000.After the transfection，the expression of survivin and PTTG was detected using western blot.ResultsThe expression of survivin and PTTG was decreased significantly at 24h，48h，and 72hafter survivin gene silencing with siRNA.（P＜0.01）.ConclusionThe expression of PTTG was decreased obviously following survivin gene silencing in colorectal cancer cell line，indicating survivin-PTTG interaction may contribute to the development of colorectal cancer.

Colorectal cancer；western blot；siRNA；PTTG

R735.3

A

1007－4287（2012）07－1174－03

吉林省科技學(xué)技術(shù)廳國(guó)際科技合作（20100753）

2011－08－24）