周春花，彭衛(wèi)東

2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院生物技術(shù)系，南昌 330031

人蛔蟲（Ascarislumbricoides）和與其同屬的豬蛔蟲（A.suum，）是具有重要社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義的常見土源性線蟲，其分類學(xué)地位一直存有爭(zhēng)議，而近20年來分子分型的研究對(duì)這兩種蛔蟲的遺傳結(jié)構(gòu)、流行病學(xué)和種群演化等方面提供了豐富的信息［1］。比如，用ITS1對(duì)我國(guó)蛔蟲的基因分型，發(fā)現(xiàn)共有5種基因型（G1－G5），在人蛔蟲種群以G1型為主（約占70%）；而豬蛔蟲種群中則以G3為主（約80%）；各基因型的在不同地區(qū)同一宿主內(nèi)的分布頻率基本上相同，而在不同宿主之間的分布明顯不同［2］。線粒體DNA的2個(gè)基因片段COX1和NAD1的篩選也得到類似結(jié)果［3］。進(jìn)一步用來自人體的G1型和來自豬體的G3型蛔蟲分別實(shí)驗(yàn)感染C57BL/6小鼠和豬，結(jié)果表明，不同基因型的蛔蟲具有不同的宿主寄生特異性［4－6］。

G2型是人蛔蟲和豬蛔蟲共有的基因型，其在人蛔蟲種群中占25.5%，而在豬蛔蟲占15.2%［2］。如果說，G1和G3型在各宿主的分別偏好提示了人型蛔蟲和豬型蛔蟲的不同宿主特異性，那么G2型是否也存在某種差異性？有趣的是，初步實(shí)驗(yàn)感染結(jié)果表明，來自人體的G2型蛔蟲不能在豬體內(nèi)發(fā)育為成蟲，而來自豬的G2型蛔蟲卻能夠在豬體內(nèi)發(fā)育為成蟲［6］；鑒于ITS1標(biāo)記不能進(jìn)一步區(qū)分G2型蛔蟲，故有必要借助其它分子標(biāo)記對(duì)其遺傳變異進(jìn)行進(jìn)一步研究。微衛(wèi)星在基因組中數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富、呈孟德爾共顯性遺傳等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物種群間親緣關(guān)系、群體內(nèi)和群體間遺傳變異等的檢測(cè)。近年來使用微衛(wèi)星標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了人蛔蟲和豬蛔蟲雜交個(gè)體的存在［7－8］以及豬蛔蟲一妻多夫現(xiàn)象［9］；另外，譜系地理學(xué)研究提示人蛔蟲線粒體COX1的H9單倍體可能是豬蛔蟲遠(yuǎn)古祖先［10］。這些都表明人蛔蟲和豬蛔蟲之間的關(guān)系并非是僅僅“同種或者異種”那么簡(jiǎn)單。尤其是對(duì)人和豬共有的占有種群相當(dāng)比例的同為G2型的蛔蟲，其遺傳變異情況尚不了解。因此，本研究通過20個(gè)常染色體微衛(wèi)星座位對(duì)中國(guó)G2型蛔蟲進(jìn)行遺傳多樣性研究，以揭示G2型人蛔蟲和G2型豬蛔蟲遺傳學(xué)差異及其在流行病學(xué)方面的可能啟示。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用的69個(gè)G2型蛔蟲樣本均來自Peng等自我國(guó)6?。ㄗ灾螀^(qū)）采集的標(biāo)本［2］，其中48條來自人體，21條來自豬體內(nèi)。

1.2 主要試劑和儀器 蛔蟲組織DNA提取試劑盒（WizardSVGenomicDNAPurificationSystem）購(gòu)自Promega公司，熒光引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，DNA Taq酶（PremixTaqVersion 2.0）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。熱循環(huán)儀為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。STR掃描由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 從卡洛氏液中取出蛔蟲樣本，剪下一小段（約5 mm）用濾紙吸去固定液并浸泡于雙蒸水中回水24 h以上，其間更換雙蒸水至少6次，吸干管中的液體，于50℃烘干15 min。參照試劑盒的操作步驟提取基因組DNA。

1.3.2 微衛(wèi)星擴(kuò)增 采用20對(duì)常染色體微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，上下游引物各0.2μmol/L，1μL DNA模板，加水至20μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的高溫PCR：94℃變性45 s，退火30 s，72℃延伸1 min，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的低溫PCR：94℃變性45 s，退火30 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸7 min。引物及退火溫度詳見表1。

1.3.3 等位基因分型 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)是否有擴(kuò)增產(chǎn)物，以及擴(kuò)增產(chǎn)物是否在所需的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。再送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行STR掃描，由該公司利用測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，配合Genemapper軟件分析確定微衛(wèi)星片斷長(zhǎng)度。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 通過 CERVUS V2.0［11］計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)、等位基因頻率、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosities，H O）、期望雜合度（expected heterozygosities，H E）和多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。利用軟件GENETIX V4.05［12］計(jì)算人蛔蟲和豬蛔蟲間的遺傳分化程度FST和基因流Nm。應(yīng)用ARLEQUIN V3.11［13］進(jìn)行分子變異方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA），估測(cè)遺傳變異在種群間和種群內(nèi)的分配情況。

2 結(jié) 果

2.1 G2型人蛔蟲和G2型豬蛔蟲的等位基因及頻率差異 G2型人蛔蟲共檢出378個(gè)等位基因，范圍在3～31，平均每對(duì)引物可檢測(cè)18.9個(gè)等位基因；G2型豬蛔蟲共檢出229個(gè)等位基因，范圍在5～19，平均每對(duì)引物可檢測(cè)11.45個(gè)等位基因。G2型人蛔蟲的等位基因頻率在0～0.821之間；G2型豬蛔蟲的等位基因頻率在0～0.833之間。20個(gè)微衛(wèi)星座位共檢測(cè)到433個(gè)等位基因，變化范圍為5～38，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)21.65個(gè)。在G2型人蛔蟲中位點(diǎn)19的多態(tài)性最豐富，有31個(gè)等位基因，在G2型豬蛔蟲中位點(diǎn)18的多態(tài)性最豐富，有19個(gè)等位基因；最少的在G2型人蛔蟲中有3個(gè)等位基因，在G2型豬蛔蟲中有5個(gè)等位基因，均為位點(diǎn)15。從各微衛(wèi)星基因座位的等位基因頻率來看，各個(gè)等位基因頻率分布不均勻，每個(gè)基因座位都有一種相對(duì)優(yōu)勢(shì)等位基因存在。20個(gè)基因位點(diǎn)中有14個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)蛔蟲種群中的優(yōu)勢(shì)等位基因一致，6個(gè)基因位點(diǎn)（位點(diǎn)1、6、10、12、16和17）在2個(gè)蛔蟲種群中的優(yōu)勢(shì)等位基因不一致。部分等位基因在不同蛔蟲種群中所占的比例存在較大的差異。兩個(gè)種群在除位點(diǎn)13G2型豬蛔蟲無特有等位基因，位點(diǎn)15G2型人蛔蟲無特有等位基因外，其它位點(diǎn)中均存在各自的特有等位基因，其中G2型人蛔蟲有204個(gè)特有等位基因，G2型豬蛔蟲有55個(gè)特有等位基因，見表2。

表1 20對(duì)微衛(wèi)星引物及退火溫度Tab.1 Twenty pairs of microsatellite primers and annealing temperature

表2 G2型人蛔蟲和豬蛔蟲各位點(diǎn)特有等位基因數(shù)Tab.2 Number of unique alleles in Ascaris from humans and pigs with genotype G2

2.2 G2型人蛔蟲和豬蛔蟲的遺傳多樣性參數(shù)G2型人蛔蟲和豬蛔蟲的觀測(cè)雜合度H O，期望雜合度H E，多態(tài)信息含量PIC，詳見表3。結(jié)果表明，G2型人蛔蟲在各位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度H O、期望雜合度H E和多態(tài)信息含量PIC分別為0.262～0.909、0.324～0.951和0.312～0.937，均值分別為0.565、0.802和0.779；G2型豬蛔蟲在各位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度H O、期望雜合度H E和多態(tài)信息含量PIC分別為0.143～0.950、0.307～0.937和0.291～0.908，均值分別為0.533、0.777和0.737。

2.3 蛔蟲種群遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu) 本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩個(gè)蛔蟲種群的F統(tǒng)計(jì)量計(jì)算為：0.3218（F IT），0.3031（FIS），0.0268（FST）。兩種群間的基因流Nm值為9.08。分子變異方差分析（AMOVA）發(fā)現(xiàn)，僅有2.6%的遺傳變異來自于種群間，其余68.6%的變異均來自于個(gè)體間，個(gè)體間遺傳變異大于種群間的遺傳變異（表4）。

表3 G2型人蛔蟲和豬蛔蟲的觀測(cè)雜合度（HO）、期望雜合度（H E）和多態(tài)信息含量（PIC）Tab.3 Observed heterozygosity（HO），expected heterozygosity（H E），and polymorphic information content（PIC）in Ascaris from humans and pigs with genotype G2

表4 G2型人蛔蟲和豬蛔蟲種群的分子變異方差分析Tab.4 Analysis of molecular variation of two Ascaris populations

3 討 論

3.1 蛔蟲微衛(wèi)星標(biāo)記和等位基因 本研究結(jié)果表明所用的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較豐富的遺傳多態(tài)性。從各位點(diǎn)的等位基因頻率來看，其頻率分布不均，每個(gè)位點(diǎn)都有一種或幾個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因（即頻率最高的等位基因）存在。在20個(gè)基因位點(diǎn)中，有14個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)蛔蟲種群中的優(yōu)勢(shì)等位基因一致，6個(gè)不一致。此外，位點(diǎn)中均存在各自的特有等位基因（表2）。種群中的優(yōu)勢(shì)等位基因往往是該物種中最保守和最原始的，而其余的等位基因則是優(yōu)勢(shì)等位基因在進(jìn)化過程中因DNA突變等機(jī)制而形成。G2型的人蛔蟲和豬蛔蟲優(yōu)勢(shì)等位基因的不同以及特有等位基因的差異，可能和它們?cè)谒拗鬟x擇上的差異［4－6］有關(guān)。

3.2 G2型人蛔蟲和豬蛔蟲種群遺傳多樣性 在微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)中，期望雜合度H E和多態(tài)信息含量PIC是用于估測(cè)種群遺傳多樣性的重要指標(biāo)。G2型人、豬蛔蟲的平均H E分別為0.802和0.777（表3），說明各自都存在較大的遺傳變異。PIC是表示微衛(wèi)星位點(diǎn)變異程度高低的一個(gè)指標(biāo)，本文中G2型人、豬蛔蟲種群在20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)都有較高的多態(tài)性。在人蛔蟲種群有4個(gè)中度、16個(gè)高度多態(tài)基因位點(diǎn)；而豬蛔蟲種群有2個(gè)中度、18個(gè)高度多態(tài)基因位點(diǎn)（表3）。同一微衛(wèi)星座位在不同蛔蟲宿主種群間以及同種宿主種群不同微衛(wèi)星座位間的多態(tài)信息含量都存在差異。前者反映了G2型人、豬蛔蟲間遺傳多樣性之間的差異，這種差異可能與宿主有關(guān)；而G2型人蛔蟲或G2型豬蛔蟲中不同的微衛(wèi)星座位之間的多態(tài)信息的差異，可能和長(zhǎng)期的自然和人為的選擇過程中（如驅(qū)蟲藥的使用），不同的微衛(wèi)星座位所受的選擇壓力不同有關(guān)。從G2型人蛔蟲和G2型豬蛔蟲在各位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度H O、期望雜合度H E和多態(tài)信息含量PIC來看，G2型人蛔蟲的遺傳多樣性和G2型豬蛔蟲的相似，均有較高的遺傳多樣性，而G2型人蛔蟲的遺傳多樣性稍高于G2型豬蛔蟲。

3.3 G2型人蛔蟲和豬蛔蟲間的種群遺傳分化和基因流分析 種群間的遺傳分化系數(shù)FST是反映各種群遺傳分化的重要指標(biāo)。本研究得出G2型人蛔蟲和G2型豬蛔蟲間的FST值為0.0268，根據(jù)Wright對(duì)FST值4個(gè)分級(jí)來判斷［14］，說明G2型的兩種蛔蟲間遺傳分化水平較低，這不僅與現(xiàn)有種群內(nèi)高的遺傳多樣性有關(guān)，還可能與種群間的基因流有關(guān)?；蛄魇欠N群遺傳結(jié)構(gòu)均質(zhì)化的主要因素之一，具有高水平基因流的物種往往比具有有限基因流的物種遺傳分化小，當(dāng)Nm＞4時(shí)，種群間的基因交流比較充分，均質(zhì)化作用足以抵制遺傳漂變的作用，可以防止種群間遺傳分化的產(chǎn)生；當(dāng)Nm＜1，遺傳漂變?yōu)榉N群遺傳結(jié)構(gòu)變化主要因素［15］。本研究G2型人蛔蟲和豬蛔蟲間的Nm為9.08，說明在蛔蟲進(jìn)化過程中，遺傳漂變未成為群體遺傳結(jié)構(gòu)變化的主要因素，G2型人、豬蛔蟲基因交流機(jī)會(huì)較多，這和從線粒體基因研究得出的結(jié)果一致［10］，而G2型人、豬蛔蟲雜交個(gè)體的客觀存在，即是這兩種蛔蟲之間較高水平基因流的證明［8］。

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