司書梅，張 濤，陳崢宏，王 菲，吳曉娟，綦廷娜，楊廷秀

2.貴陽市第一人民醫(yī)院，貴陽 550004

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是一種 常見的可持續(xù)感染人體胃黏膜的病原體。Hp的感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌以及MALT淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，克拉霉素是根除Hp治療方案中常用抗生素之一。近年來發(fā)現(xiàn)，Hp對克拉霉素的耐藥性逐年增高，因而了解之有利于臨床科學(xué)地選擇抗菌藥物。研究發(fā)現(xiàn)，Hp23S r RNA V區(qū)上的點(diǎn)突變，與克拉霉素耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。特對貴陽地區(qū)Hp臨床耐藥菌株的23S r RNA基因突變的特征進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)控菌株Hp菌株NCTC l l637，SS1，獲贈于中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。

1.1.2Hp臨床菌株來源 臨床標(biāo)本來自貴陽市第一人民醫(yī)院消化科內(nèi)鏡室胃鏡檢查病人（慢性胃炎 、胃潰瘍 、十二指腸球部潰瘍）。

1.1.3 引物 采用 Primer blast設(shè)計(jì)引物，primer1－F：5′－TGGCGTAACGAGATGGGAGCTGT －3′和 primer1－R：5′－AGTCTTTGTGCGAGCTTAGGGA－3′，擴(kuò)增Hp23S r RNA基因功能區(qū)V區(qū)（2055～2889）片段。

1.1.4 試劑 哥倫比亞培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司，批號100724），幽門螺桿菌添加劑（英國，OXOID），MH培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑，批號110105），克拉霉素（中國食品藥品檢定研究院，批號130558－200902），2×Taq PCR Master MIX（北京天根生化科技有限公司），微需氧產(chǎn)氣袋（日本，三菱化學(xué)株式會社），厭氧罐（日本，三菱化學(xué)株式會社），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1Hp的分離培養(yǎng)和鑒定 無菌操作，將活檢組織剪碎迅速接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，微需氧環(huán)境，37℃培養(yǎng)3～6 d。將疑似菌株經(jīng)革蘭染色初步鑒定后劃線分離培養(yǎng)，挑取單菌落傳代培養(yǎng)，經(jīng)革蘭染色、快速尿素酶試驗(yàn)和Hp16S rDNA特異性PCR擴(kuò)增［1］進(jìn)行鑒定，將Hp陽性菌株于綿羊血中－80℃保存。

1.2.2Hp克拉霉素敏感性檢測 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會制定的瓊脂稀釋法檢測Hp克拉霉素敏感性，克拉霉素的 MIC≥1μg/m L判為耐藥，質(zhì)控菌株選用 NCTC 11637和SS1。

1.2.3Hp23S r RNA基因片段的PCR擴(kuò)增和測序 挑選Hp克拉霉素耐藥菌株10株，敏感菌株4株，質(zhì)控菌株NCTC 11637和SS1。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取HpDNA。選用引物primer1－F和primer1－R，擴(kuò)增Hp23S r RNA基因功能區(qū)V區(qū)片段（2055～2899）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，交北京諾賽基因測序公司進(jìn)行測序。

1.2.4Hp23S r RNA基因序列分析 將臨床分離株測序所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，采用CLC Free Workbench 4.5 進(jìn) 行 比 對 分 析，以 文 獻(xiàn)［2－4］的 敏 感 菌 株U27270的基因序列為參考，尋找與耐藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1Hp分離培養(yǎng)和鑒定結(jié)果 132例臨床標(biāo)本微需氧培養(yǎng)3～6d后，經(jīng)革蘭染色鏡檢陽性，快速尿素酶試驗(yàn)陽性，16S r DNA鑒定陽性并傳代培養(yǎng)，得到可用于藥敏試驗(yàn)的純Hp培養(yǎng)物42例。

2.2Hp臨床分離株克拉霉素敏感性 42株貴陽地區(qū)Hp臨床分離株中克拉霉素敏感株29株，耐藥株13株，耐藥率為30.9%。

2.3 貴陽地區(qū)Hp臨床分離株23S r RNA V區(qū)基因片段序列的堿基多態(tài)性 經(jīng)測序共得到14株Hp臨床分離株和質(zhì)控菌株NCTC 11637和SS1的23S r RNA V區(qū)基因片段序列，其中已有7株基因序列 被 GenBank收錄 （GenBank Accession：JQ756441～756447）。

貴陽地區(qū)10株Hp臨床耐藥株中，2144位點(diǎn)有6株為G，4株為A；2183位點(diǎn)10株均為C；2196位點(diǎn)有1株為T，9株為C；2224位點(diǎn)有1株為G，9株為A；2245位點(diǎn)有9株為C，1株為T。4株Hp臨床敏感株中，2183位點(diǎn)3株為C，1株為T；2224位點(diǎn)2株為A，2株為G；2245位點(diǎn)4株均為C；克拉霉素敏感的Hp質(zhì)控菌株NCTC11637與SS1中2245位點(diǎn)均為C，其他位點(diǎn)與參考菌株U27270一致，見表1。

表1 貴陽Hp臨床菌株克拉霉素耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的堿基分布Tab.1 Distribution on locus related with clarithromycin resistance mutations of Helicobacter pylori clinical isolates in Guiyang

3 討 論

據(jù)國外報(bào)道，Hp對克拉霉素耐藥率為1%～20%。而1999年北京地區(qū)為10.0%［5］，2006年西安地區(qū)達(dá)33.3%［6］，2009年重慶地區(qū)為29.17%［7］。本文結(jié)果顯示，貴陽地區(qū)克拉霉素耐藥率高達(dá)30.9%。

克拉霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類藥物，其抗菌機(jī)制是藥物穿透入菌體細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)菌核糖體緊密結(jié)合，作用于23S r RNA V區(qū)的多肽轉(zhuǎn)移酶環(huán)，抑制多肽轉(zhuǎn)移酶活性，影響核糖體的移位過程，阻止肽鏈延長，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到殺菌目的。

Versalovic［8］等首次發(fā)現(xiàn)Hp23S r RNA 基因V區(qū)上的點(diǎn)突變，與克拉霉素的耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。各國研 究 者［4，9－11］對Hp23S r RNA V 區(qū) 的 研究發(fā)現(xiàn)，與克拉霉素耐藥相關(guān)的突變包括：A2115G、G2141A、 A2143G/C、 A2144G/C/T、 T2183C、A2224G、T2289C、T2717C、C2196T 等。不同國家和地區(qū)的克拉霉素耐藥菌株23S r RNA基因V區(qū)的部分位點(diǎn)存在堿基的多樣性。巴西［4］52株克拉霉素耐藥株中94.2%有A2143G和A2144G突變，其中A2143G的突變與克拉霉素高水平耐藥相關(guān)。法國［12］199株Hp耐藥率為135/199，127株發(fā)生A2144G、A2143G突變，8株發(fā)生A2143C突變。孟加拉國［2］12株克拉霉素耐藥株中未發(fā)生A2143G和A2144G突變，卻存在T2183C突變，且該位點(diǎn)的突變與耐藥相關(guān)。本文對GenBank中序列（Gen－Bank Accession：AB088050－AB088065）分析發(fā)現(xiàn)，日本克拉霉素耐藥株基因突變主要包括A2143G、A2144G、T2183C 、T2245C，但 T2183C、C2196T、A2224G和T2245C的突變同時(shí)也存在于該地區(qū)克拉霉素敏感菌株中。

經(jīng)序列分析，貴陽地區(qū)10株耐藥菌株的23S r RNA基因片段的堿基突變包括T2183C（10/10）、T2245C（9/10）、A2144G（6/10）、C2196T（1/10）、A2224G（1/10），不存在文獻(xiàn)報(bào)道的與耐藥性有關(guān)的A2143G/C突變，而敏感菌株在2183、2245和2224位點(diǎn)也存在堿基的差異。本文有1株耐藥菌株發(fā)生了C2196T突變，但對GenBank中相關(guān)序列的分析發(fā)現(xiàn)，該突變也存在于日本敏感菌株（GenBank Accession：AB088050－AB088056）。日本菌株和貴陽菌株一致的是A2144G突變只存在于耐藥菌株。綜上所述，2144位點(diǎn)突變與貴陽幽門螺桿菌克拉霉素耐藥相關(guān)，而其他位點(diǎn)的突變是否與耐藥性相關(guān)有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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