戴曉春，黃曉燕，周希，高瞻，王本極，張艷麗，楊德業(yè)

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，溫州醫(yī)學(xué)院心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000）

室間隔缺損（ventricular septum defect，VSD）是常見的先天性心臟病，楊德業(yè)教授的研究組已證實(shí)Pax-8與下游基因NR4A1是和VSD生長發(fā)育相關(guān)的基因，Pax-8基因被系統(tǒng)敲除后，顯示左心室肌和室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重，同時(shí)伴有線粒體體積減少，數(shù)量增多[1-2]。大多數(shù)的研究顯示，線粒體在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起了重要作用，特別是線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白 2（uncoupling protein 2，UCP2)。UCP2具有質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，引起線粒體質(zhì)子漏，使氧化磷酸化解偶聯(lián)，調(diào)控線粒體合成ATP，抑制線粒體內(nèi)活性氧族（ROS）[3]。ROS參與了凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同階段[4]。上述研究提示UCP2是一個(gè)重要的凋亡調(diào)節(jié)基因。本實(shí)驗(yàn)觀察Pax-8基因抑制后心肌細(xì)胞中UCP2的變化，探討UCP2在心肌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：Pax-8基因敲除的純合子小鼠（Pax-8 KO-/-）、Pax-8基因敲除的雜合子小鼠（Pax-8 KO+/-）和野生型小鼠（Pax-8 KO+/+）各10只。（Pax-8 KO+/-）小鼠由德國Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠贈。

1.1.2 細(xì)胞：H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫，置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.1.3 試劑：Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒1、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，小鼠抗大鼠Pax-8抗體、小鼠抗大鼠UCP2抗體、兔抗小鼠IgG抗體購自英國Abcam公司，小鼠抗GAPDH抗體購自上海康成生物工程有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自美國Cell Signal 公司，RT試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司，PCR試劑盒購自美國Promega公司，PMSF RIPA BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇海門碧云天試劑公司，線粒體提取試劑盒購自美國Pierce公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR鑒定小鼠基因型：剪取小鼠尾尖0.5～1 cm，消化小鼠尾巴，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物為5’-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’，5’-GC TAAGAGAA-GGTGGATGAGAG-3’，5’-GATGCTGCCAGTCTC GTAG-3’，目的基因片斷長度分別為370 bp和390 bp。PCR采用20μL體系，其中含有DNA 0.8μL，10×緩沖液2μL，特異性引物各0.8μL，Taq DNA聚合酶0.15μL，dd H2O 11.45μL；反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，94℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，每組取6μL PCR產(chǎn)物用含Gold View的15%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)（Quantity One）攝像分析。

1.2.2 Pax-8 siRNA的表達(dá)效率：轉(zhuǎn)染后48 h，Trizol試劑裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA。Pax-8 siRNA組、NC siRNA組和空白對照組均各取3μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取各組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別行PCR，擴(kuò)增Pax-8和GAPDH片段。Pax-8上游引物為5’-CGGCAA CGCATTGTGGA-3’，下游引物為5’-GTCCTGGGCTCA GAGATTTGG-3’，產(chǎn)物210 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物為5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，產(chǎn)物123 bp。Pax-8反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min后，94℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。GAPDH反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min后，94 ℃ 30 s，54.6 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min每組取10μL PCR產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。Western blot法檢測Pax-8蛋白表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染后24 h，裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，各組上樣50μg，行10% SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，7.5%脫脂牛奶封閉2.5 h。小鼠抗大鼠Pax-8抗體（1:100）4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入兔抗小鼠IgG抗體（1:2000）孵育1.5 h，洗膜3次。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化Pax-8蛋白質(zhì)表達(dá)。用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.2.3 UCP2在Pax-8抑制后心肌細(xì)胞中的表達(dá)：RTPCR法檢測UCP2表達(dá)水平。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，UCP2上游引物為5’-CGACAAC CACCCAATGAAT-3’，下游引物為5’-GAGTGCCCTCAG CGAAGTC-3’，產(chǎn)物大小為324 bp；GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物為5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，產(chǎn)物大小為123 bp。管家基因GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化UCP2 mRNA表達(dá)。UCP2反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。GAPDH反應(yīng)條件如下：94 ℃變性5 min后， 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)后72 ℃ 10 min，每組取6μL PCR產(chǎn)物用含Gold View的15%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)（Quantity One）攝像分析。Western blot法檢測UCP2蛋白表達(dá)水平。取小鼠心臟組織（或心肌細(xì)胞），線粒體試劑盒提取線粒體，裂解線粒體提取線粒體的蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組上樣100μg，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h。小鼠抗大鼠UCP2 抗體（1:400）孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入兔抗小鼠IgG抗體（1:5000）孵育1.5 h，洗膜3次，10 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化UCP2蛋白質(zhì)表達(dá)，Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 16.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，獨(dú)立的兩組間比較用SNK-q檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定小鼠基因型 雌的（Pax-8 KO+/-）和雄的（Pax-8 KO+/-）交配可獲得Pax-8 KO-/-（純合子）和Pax-8 KO+/-（雜合子），小鼠出現(xiàn)一條370 bp左右條帶為Pax-8基因敲除小鼠純合子（Pax-8 KO-/-），370 bp和390 bp左右條帶為Pax-8基因敲除小鼠雜合子（Pax-8 KO+/-），390 bp左右條帶為野生型（Pax-8 KO+/+），如圖1。

圖1 小鼠基因型鑒定

2.2 RT-PCR檢測Pax-8 siRNA的表達(dá)效率 與NC siRNA組（mRNA為0.69±0.15，蛋白為0.75±0.10）相比，Pax-8 siRNA組Pax-8 mRNA（0.26±0.11）表達(dá)下調(diào)62.31%（P<0.05），蛋白（0.34±0.06）表達(dá)下調(diào)54.67%（P<0.05）。與空白對照組（mRNA為0.72±0.23，蛋白為0.84±0.19）比較，Pax-8siRNA組Pax-8的mRNA表達(dá)下調(diào)63.89%（P<0.05），蛋白表達(dá)下調(diào)59.52%（P<0.05）。NC siRNA組與空白對照組的Pax-8 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖2。

2.3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)與Pax-8基因敲除小鼠雜合子（Pax-8 KO+/-）組（mRNA為0.85±0.23，蛋白為0.86±0.14）相比，Pax-8基因敲除小鼠純合子（Pax-8 KO-/-）組UCP2的mRNA（1.29±0.25）的表達(dá)上調(diào)34.11%（P<0.05），蛋白（1.26±0.13）的表達(dá)上調(diào)31.75%（P<0.05），與野生型（Pax-8 KO+/+）組UCP2（mRNA為0.84±0.23，蛋白為0.80±0.17）相比，實(shí)驗(yàn)組Pax-8基因敲除小鼠純合子（Pax-8 KO-/-）組UCP2的mRNA表達(dá)上調(diào)34.88%（P<0.05），蛋白表達(dá)上調(diào)36.50%（P<0.05），而對照組之間，Pax-8基因敲除小鼠雜合（Pax-8 KO+/-）組和野生型（Pax-8 KO+/+）組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖3。

圖2 Pax-8 siRNA的表達(dá)效率檢測

圖3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)

2.4 Pax-8 siRNA組的UCP2表達(dá)上調(diào) 與NC siRNA組的UCP2（mRNA為0.78±14，蛋白為0.77±0.19）相比，Pax-8 siRNA組UCP2（mRNA為1.07±0.08）的表達(dá)上調(diào)27.10%（P<0.05），蛋白表達(dá)（1.02±0.20）上調(diào)24.50%（P<0.05）。與空白對照組的UCP2（mRNA為0.77±0.1，蛋白為0.75±0.13）比較，Pax-8 siRNA組UCP2的mRNA表達(dá)上調(diào)28.03%（P<0.05），蛋白質(zhì)上調(diào)26.47%（P<0.05）。NC siRNA組與空白對照組的UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖4。

圖4 Pax-8基因干擾后UCP2在大鼠心肌中的表達(dá)

3 討論

解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein，UCP2）屬于線粒體陰離子載體家族成員，基因位于小鼠的第7條染色體、人的第11條染色體上[5]。它是一種介導(dǎo)線粒體質(zhì)子漏的蛋白，降低線粒體在呼吸時(shí)形成的H+梯度，使氧化磷酸化解偶聯(lián)，ATP合成降低，以及膜電位下降[6]。UCP2 mRNA廣泛存在于骨骼肌、心肌、胎盤、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、肺、胃、和小腸等組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[7]，然而UCP2蛋白僅在少數(shù)組織中表達(dá)，包括胰腺、胃、脾、心、腦和肺中[8]。目前研究表明UCP2可以調(diào)節(jié)胰島素的分泌[9]、Ca2+超載、ROS[10]的生成，以及調(diào)節(jié)ATP的合成[11]。然而，關(guān)于UCP2蛋白的生理功能仍然存在許多爭論，越來越多的研究表明UCP2在不同組織中可能發(fā)揮不同的生理功能。在不同類型細(xì)胞中，UCP2過表達(dá)可能導(dǎo)致不同繼發(fā)效應(yīng)，如在成纖維細(xì)胞中，UCP2過表達(dá)對細(xì)胞的生長及存活無影響，但在HeLa細(xì)胞中UCP2過表達(dá)卻能夠降低線粒體跨膜電壓并促進(jìn)細(xì)胞死亡[12]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，與Pax-8基因敲除雜合子和野生型小鼠心肌細(xì)胞相比，Pax-8基因敲除純合子小鼠心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯上調(diào)；同時(shí)，與NC siRNA組和空白對照組相比，Pax-8 siRNA組UCP2的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)，而Pax-8基因抑制后的心肌細(xì)胞凋亡明顯增加[2，13]。Pax-8基因敲除的純合子小鼠心臟研究結(jié)果顯示心臟成球形，左心室壁肥厚，室間隔增厚，左心室乳頭肌肥大。病理學(xué)顯示左心室肌和室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重， 同時(shí)伴有線粒體體積減少，數(shù)量增多。Pax-8基因敲除的純合子小鼠在出生后即表現(xiàn)出心室重構(gòu)[2]。左室重構(gòu)時(shí)，心肌單位橫截面上毛細(xì)血管密度降低，導(dǎo)致心肌相對供血不足，處于相對能量缺乏和低氧狀態(tài)，心肌細(xì)胞ROS增多，導(dǎo)致線粒體溶解，甚至心肌細(xì)胞凋亡[14-15]。Maron等[16]指出，心肌肥大早期，線粒體體積代償性增加，但是在晚期，其體積則縮小，此為肥大心肌趨于衰竭的形態(tài)特征， 心肌細(xì)胞中線粒體的機(jī)能主要和有氧代謝產(chǎn)生化學(xué)能有關(guān)，故其所占心肌細(xì)胞的容積與能量利用有關(guān)。我們認(rèn)為可能的機(jī)制為：Pax-8基因抑制后，心室進(jìn)行重構(gòu)，在室間隔心室重構(gòu)中，心肌細(xì)胞的肥大和纖維化增加，使單位橫截面上的心肌細(xì)胞數(shù)量減少，而單位橫截面上的UCP2仍然保持較高水平，說明單個(gè)心肌細(xì)胞中UCP2含量上升。心室重構(gòu)導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS增多[17]，此時(shí)，UCP2增加雖然能拮抗ROS的增長[18]，延緩纖維化、室間隔心室重構(gòu)的進(jìn)程，減少細(xì)胞的凋亡，但同時(shí)使心肌細(xì)胞ATP產(chǎn)生的障礙加重，使細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們推測Pax-8基因抑制后，UCP2基因的表達(dá)上調(diào)，室間隔心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重。然而UCP2是一個(gè)雙向因素，如果能在保證心臟能量供給充足的情況下，同時(shí)對UCP2基因進(jìn)行干預(yù)，可能會減少室間隔細(xì)胞的凋亡，但是其具體機(jī)制還未明確，有待進(jìn)一步研究。

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