楊 姣，周雪瑩，歷 文，朱曉琳，牛哲峰，張玉璽，李士峰，張美俠*

原發(fā)性肝癌是嚴重危害人類健康的重大疾病，是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］，其治療仍然主要依賴于全身化療和相關(guān)治療如介入栓塞化療等。肝癌對化療藥物的敏感性較差，不論是單藥還是多藥聯(lián)合化療，其有效率均為10% ～20%。阿霉素(Doxorubicin，Dox)是臨床治療肝癌的常用藥物，但其反應率僅為15% ～20%。影響其療效的主要原因是腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥(Multi-drug resistance，MDR)，使細胞內(nèi)抗癌藥物積聚程度降低。

葫蘆素類(Cucurbitacins)成分是從植物中提取的一類高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，主要成分為葫蘆素B、E、I等，具有抗腫瘤、抗炎、提高機體免疫力等多種生物活性［2-3］。Sadzuka 等［4-5］報道，葫蘆素E通過促進阿霉素的細胞內(nèi)泵入和降低其外排而提高阿霉素在腫瘤細胞中的濃度。因此，筆者推測，葫蘆素B可能通過相同的機制提高肝癌細胞內(nèi)阿霉素的濃度，進而提高阿霉素的抗腫瘤效果。本研究以人源性肝癌細胞HepG2和鼠源性肝癌細胞H22為對象，利用反相高效液相-熒光測定法測定腫瘤細胞內(nèi)阿霉素濃度，用于HepG2和H22細胞內(nèi)阿霉素濃度的動態(tài)研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 注射用鹽酸表阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，葫蘆素B、阿霉素(沈陽藥科大學提供)。甲醇色譜純(天津四友生物醫(yī)學技術(shù)有限公司)，醋酸分析純(天津四友生物醫(yī)學技術(shù)有限公司)。高效液相色譜儀(Waters Model 1525，美國)，包括在線真空脫氣機、高壓二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱，Agilent 1100色譜工作站;熒光檢測器(Waters 2475，美國);色譜柱(150 ～4.6 mm，C18，Sunfine，Waters，美國)。

1.2 色譜條件 色譜柱:Waters Sunfine C18柱，4.6 mm ×150 mm，5 μm;流動相:甲醇-0.01% 醋酸(40∶60，V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;熒光檢測激發(fā)波長:495 nm，發(fā)射波長:560 nm;進樣量:10 μL。

1.3 標準儲備液的制備 準確稱取鹽酸阿霉素適量，加水溶解，定容于容量瓶，配制成濃度為5 μg/mL的阿霉素標準儲備液，4℃保存。

1.4 HepG2細胞樣品的制備

1.4.1 HepG2流入細胞阿霉素樣品的預處理取對數(shù)生長期HepG2細胞，按每孔5×106個/mL接種于6孔板培養(yǎng)，過夜貼壁后，棄上清，每孔加1 mL不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。將細胞分為3組，第1組(Dox組)加阿霉素(5 μg/mL);第2組(Dox+CuB 1 μM 組)先加葫蘆素B 1 μM，30 min后加入阿霉素(5 μg/mL);第3組(Dox+CuB 10 μM 組)先加葫蘆素 B 10 μM，30 min 后加入阿霉素(5 μg/mL)。于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 0、30、60、120、180、240 min。棄上清，加0.25%胰酶消化，用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入表阿霉素(5 μg/mL)做內(nèi)標，再加入1 mL含0.3 mol/L鹽酸的50%乙醇萃取，充分混勻后，渦旋2 min，超聲波震蕩10 min。將樣品放置37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育 18 h，最后 10 000 r/min離心 10 min，取10 μL上清液進樣測定。

1.4.2 HepG2細胞阿霉素泵出樣品的預處理取對數(shù)生長期HepG2細胞，接種于貼壁培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。貼壁后棄上清，加入阿霉素(5 μg/mL)，在37℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。棄上清，加PBS洗3遍，加0.25%胰酶消化，用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻。分成3組，第1組不加任何藥品;第2組加入葫蘆素B 1 μM，第3組加入葫蘆素B 10 μM。將樣品放入37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng) 0、30、60、90、120 min。收集細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入表阿霉素(5 μg/mL)做內(nèi)標，加入1 mL含0.3 mol/L鹽酸的50%乙醇萃取，充分混勻后，渦旋2 min，超聲波震蕩10 min。將樣品放置37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育18 h，最后10 000 r/min離心10 min，取10 μL上清液進樣測定。

1.5 H22細胞樣品的制備 取H22懸浮細胞(1×107個/mL)，加PBS洗3遍，加入不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。其余同HepG2細胞。

1.6 統(tǒng)計方法 SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線的繪制 取阿霉素標準液適量，配制濃 度 分 別 為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/mL的 HepG2 細胞液樣品，取 10 μL 進行HPLC分析，以待測物阿霉素濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標物表阿霉素的峰面積比值為縱坐標，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程，即為標準曲線。結(jié)果表明，HepG2細胞液樣品中阿霉素在0.1～6.4 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，標準曲線:Y=1.649 2 X+0.221(R2=0.993 4)。同法顯示，H22細胞液樣品中，阿霉素在0.625～20 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，標準曲線:Y=0.13 X+0.067 4(R2=0.996)。

2.2 專屬性實驗 分別取空白HepG2細胞和H22細胞，不加任何藥物，其余按其樣品預處理項下流入細胞樣品預處理操作。將一定濃度的阿霉素標準溶液和內(nèi)標溶液加入空白HepG2細胞和H22細胞中，依“1.4.1”項下和“H22細胞阿霉素流入樣品的預處理”項下方法操作。結(jié)果表明，空白HepG2細胞和H22細胞中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿霉素和內(nèi)標的測定，表明專屬性良好。

2.3 精密度實驗 取阿霉素標準液適量，按“2.1”項操作，制備低、中、高(濃度為 0.25、1.00、4.00 μg/mL)3個濃度細胞液樣品，每個濃度5個樣本，按日內(nèi)和日間精密度測定要求分別進行測定。計算日內(nèi)及日間精密度，結(jié)果顯示，HepG2細胞液日內(nèi)精密度RSD分別為2.952%、0.883%、0.982%(n=5)，日間精密度 RSD分別為1.256%、1.826%、3.589%(n=5)，表明精密度良好。H22細胞日內(nèi)精密度RSD分別為2.418%、2.797%、2.459%(n=5)，日間精密度RSD分別為1.826%、3.589%、2.759%(n=5)，表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗 取阿霉素標準液適量，按“2.1”項下操作，制備濃度4.00 μg/mL的細胞液樣品，在 0、1、5、10、18、24、36、48 h 測定，結(jié)果HepG2細胞液RSD=3.13%(n=8)，表明在測定時間內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。H22細胞RSD=3.45%(n=8)，表明在測定的時間內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.5 回收率實驗 取空白HepG2和H22細胞液適量，按其“1.4”項下方法，取阿霉素標準液適量，加入制得的上清液中，制備低、中、高(0.25、1.00、4.00 μg/mL)3個濃度的細胞液樣品，渦流混合，取10 μL進行HPLC分析，按照標準曲線計算提取回收率，HepG2細胞液平均回收率為107.4%，表明回收率良好(見表1);同法測得H22細胞液平均回收率為105.93%，表明回收率良好(見表2)。

表1 HPLC法測定HepG2細胞液回收率(n=5)

表2 HPLC法測定H22細胞液回收率(n=5)

2.6 葫蘆素B對阿霉素在肝癌細胞中濃度的影響 由于阿霉素能自發(fā)熒光，而葫蘆素B不能自發(fā)熒光，所以用熒光檢測器測得的圖譜為阿霉素和內(nèi)標物質(zhì)表阿霉素的色譜圖。以時間為橫坐標、阿霉素和表阿霉素的峰面積比值為縱坐標，做線性回歸圖，并分析葫蘆素B對肝癌細胞中阿霉素濃度的影響。

2.6.1 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內(nèi)流入的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后在細胞內(nèi)的濃度升高，呈時間、濃度依賴性。在240 min時間點，Dox+CuB 10 μM組與 Dox組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內(nèi)流入的影響

2.6.2 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內(nèi)泵出的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后，從細胞內(nèi)泵出的藥量減少。Dox+CuB 1 μM組在120 min時間點、Dox+CuB 10 μM 組在90 min及120 min時間點與Dox組之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖2。

2.6.3 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內(nèi)流入的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后在細胞內(nèi)濃度增加，且呈時間和濃度依賴性。Dox+CuB 1 μM組、Dox+CuB 1 μM 組與 Dox 組在60、120、180 min和/或240 min時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)，見圖3。

圖2 葫蘆素B對阿霉素在HepG2細胞內(nèi)泵出的影響

圖3 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內(nèi)流入的影響

2.6.4 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內(nèi)泵出的影響 阿霉素與葫蘆素B聯(lián)合應用后，從細胞內(nèi)泵出的藥量減少。Dox+CuB 10 μM組與Dox組在90 min與120 min時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖4。

圖4 葫蘆素B對阿霉素在H22細胞內(nèi)泵出的影響

3 討論

近年來，腫瘤增殖抑制作用逐步成為一個研究熱點。葫蘆素B可以抑制多種腫瘤細胞如乳腺癌、鼻咽癌、喉癌、口腔鱗癌、肺癌、宮頸癌、肝癌、結(jié)腸癌、惡性黑色素瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等的增殖［6-12］。腫瘤細胞MDR原因之一是腫瘤細胞過表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白，如P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)和肺癌耐藥蛋白(LRP)等［13］。P-gp等能將細胞內(nèi)的藥物“泵”出細胞外，這與天然來源和疏水性藥物(如阿霉素)耐藥有關(guān)。本研究結(jié)果表明，葫蘆素B與阿霉素聯(lián)合應用，明顯抑制人肝癌細胞系HepG2和鼠源性肝癌細胞系H22生長。葫蘆素B可以濃度、時間依賴性地促進阿霉素在肝癌細胞HepG2及H22中的內(nèi)流，抑制阿霉素從細胞內(nèi)外排。因此，提高阿霉素在肝癌細胞中的濃度，可增強其抗腫瘤活性。

抗癌藥物的作用機制錯綜復雜，葫蘆素B與阿霉素共同抑制肝癌的詳細機制(如:葫蘆素B是否抑制P-gp的過度表達)，還有待進一步深入研究。本文方法簡便、準確，檢測限低，線性范圍寬，可分析測定腫瘤細胞內(nèi)阿霉素濃度，并可拓展用于研究化療藥物在腫瘤細胞內(nèi)外動態(tài)變化規(guī)律，探索腫瘤細胞MDR機制，進而用于尋找發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞MDR逆轉(zhuǎn)藥物。

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