朱 英 劉 平

1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 (遼寧 大連，116011) 2.上海中醫(yī)藥大學

目前纖維化或早期硬化組織器官的結構重構成為現(xiàn)代生物醫(yī)學中的重大科學問題，而干細胞已成為組織器官結構重構過程中的研究焦點。干細胞是一類具有自我更新和多向分化增殖潛能的原始細胞，其對細胞的生理性更新、對病理性損傷的反應與修復以及組織重構都具有重要意義。

研究顯示肝損傷過程中，干細胞參與了肝細胞再生和肝損傷修復，骨髓、胚胎等多種來源的干細胞也具有向肝細胞分化的潛能，因此從干細胞的角度探討肝細胞再生機制及再生肝臟功能具有可行性和重要性。

本研究應用二甲基亞硝胺 (DMN)造成類似于人類的大鼠肝硬化模型，應用較為敏感的Thy-1.1作為肝臟卵圓細胞(HOC)標記物，觀察HOC在肝硬化形成與消減過程中的動態(tài)變化;同時應用雙重熒光免疫激光共聚焦檢測技術觀察HOC的分化取趨向，應用黃芪湯治療，觀察黃芪湯在肝硬化逆轉(zhuǎn)中的作用及其對HOC的影響，探討中藥在肝硬化組織重構過程中的作用與意義。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 wistar大鼠，雄性，體重160g±15g，清潔級，由中國科學院上海實驗動物中心提供。于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心清潔區(qū)動物房飼養(yǎng)、造模和觀察，自由飲食。DMN為東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品：lot.MAL05。鼠抗Thy1.1單克隆抗體為SeroTec公司產(chǎn)品;鼠抗CK19和AFP單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品;激光共聚焦檢測用cy3標記 (紅色)羊抗單克隆抗體及FITC標記 (綠色)驢抗單克隆抗體均為Jackson Immuno Research公司產(chǎn)品。

1.2 藥物與儀器 黃芪湯(《和劑局方》，由黃芪、炙甘草、大棗組成)、由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心進行水煎濃縮取汁，制成流浸膏，冷凍干燥，閉光保存。激光共聚焦顯微鏡，為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，共聚焦型號為 FV1000SIMS Scanner，所用譜線為 488nm、543nm兩種激光譜線，物鏡為 PLSAPO60X(數(shù)值孔徑為1.4)，顯微鏡型號為IX81。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備 87只雄性，wistar大鼠，重量為160g±15g。除正常組25只外，其余62只均參照Jenkins等人的方法制備DMN肝硬化模型。按DMN 10mg·kg-1劑量 (用生理鹽水稀釋)處理動物，腹腔注射，每周連續(xù)3天，1次/d，共4周。正常組大鼠腹腔注射同等量生理鹽水。分別于造模后3天、2周、4周、6周、8周時均隨機處死造模大鼠6只，正常組大鼠3只，進行肝臟動態(tài)觀察。

1.3.2 分組與給藥 4周造模完成后，將50只造模大鼠隨機分為模型組25只，黃芪湯組25只。黃芪湯組大鼠于第5周第1天起，按60kg成人體重日劑量的公斤體重劑量10倍量灌胃 (10ml·kg-1體重的劑量)，1次/d，共兩周;正常組(10只)及模型組大鼠以同體積生理鹽水給予灌胃。

1.3.3 觀察指標 觀察大鼠血清肝功能羥脯氨酸 (Hyp)含量變化，觀察肝組織HE染色、膠原纖維染色結果并進行肝組織HOC透射電鏡檢測。肝組織α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)Thy1.1免疫組化觀測，用 Envision法;肝組織 α-SMA、Thy1.1蛋白定量分析用免疫印跡法;肝組織AFP、CK19與Thy1.1共定位，采用雙重熒光免疫共聚焦激光掃描顯微鏡技術檢測 (Double Immuno Confocal Laser Scan Microscopy，DICLSM)。取冰凍肝組織切片，丙酮固定10分鐘，Blocking Buffer室溫封閉1小時，加鼠抗Thy1.1抗體4℃過夜，加cy3標記羊抗鼠二抗室溫避光2小時，4%PFA固定20分鐘，加抗鼠AFP、CK19抗體室溫2小時，加FITC標記驢抗鼠二抗室溫避光2小時，moviol封片，于激光共聚焦顯微鏡檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 計量資料用計算機統(tǒng)計軟件SPSS 10.0中的ANOVA程序進行單因素方差分析，并用LSD程序進行兩兩比較。

2 結果

2.1 3 組大鼠肝功能檢測結果 見表1。

表13 組大鼠肝功能檢測結果比較(±s)

表13 組大鼠肝功能檢測結果比較(±s)

與正常組比較，＊＊P＜0.01，與模型組比較，△P＜0.05

組別 n ALT(U/L) AST(U/L)TBil(mg/dl) Alb(g/L)正常組 5 32.86 ±8.70 64.52 ±9.42 0.25 ±0.05 27.39 ±1.46模型組 16 61.89±19.99 115.57 ±26.67＊＊0.54 ±0.33＊＊22.43 ±4.83＊＊黃芪湯組 12 62.02±11.76 97.61 ±6.53△0.33 ±0.08 △25.71 ±3.07△

2.2 3 組大鼠肝組織羥脯氨酸 (Hyp)檢測結果見表2。

表23 組大鼠肝組織Hyp檢測結果比較(±s)

表23 組大鼠肝組織Hyp檢測結果比較(±s)

與正常組比較，＊＊P＜0.01，與模型組比較，△P＜0.05

組別 n Hyp(ug/g Liver)正常組6153.24 ±17.40模型組 16 288.55 ±41.58＊＊黃芪湯組 12 252.22 ±30.93△

2.3 3 組大鼠肝組織HE染色結果 見插頁圖1。

2.4 3 組大鼠肝組織天狼星紅染色結果 見插頁圖2。

2.5 3 組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達 結果顯示，實驗6周時模型組大鼠肝組織α-SMA表達明顯多于正常組，主要表達于星狀細胞，位于匯管區(qū)、纖維間隔及肝竇部位。與模型組大鼠比較，黃芪湯組大鼠α-SMA表達減少。α-SMA蛋白免疫印跡分析結果顯示，6周模型組大鼠α-SMA蛋白表達量顯著高于正常組。與模型組比較，黃芪湯組表達量顯著減少。

2.6 3 組大鼠肝組織AFP，CK19與Thy1.1共定位 見表3。

表3 3組大鼠肝組織AFP，CK19與Thy1.1共定位 (±s)

表3 3組大鼠肝組織AFP，CK19與Thy1.1共定位 (±s)

與模型組比較，＊＊P＜0.01

組別 n AFP(%) CK19 and Thy1.1(%)正常組300模型組 3 3.18 ±0.08 2.83 ±0.06黃芪湯組 3 1.08±0.03＊＊ 10.98±0.04＊＊

2.7 AFP與Thy1.1共定位的變化 正常組大鼠肝組織中未見到AFP與Thy1.1共定位陽性細胞表達，6周時模型組大鼠肝組織有較多表達;與模型組比較，黃芪湯組大鼠肝組織AFP與Thy1.1共定位陽性細胞表達量顯著降低 (P＜0.01)，(見插頁圖3)。

2.8 CK19與Thy1.1共定位的變化 正常組大鼠肝組織中未見到CK19與Thy1.1共定位陽性細胞，6周時模型組大鼠肝組織有顯著表達;與模型組比較，黃芪湯組大鼠肝組織中CK19與Thy1.1共定位陽性細胞表達量顯著增加 (P＜0.01)，(見插頁圖4)。

3 討論

近年來，隨著干細胞研究的不斷深入，越來越多的研究表明，干細胞移植治療肝病具有重要的臨床應用價值。大量體內(nèi)外研究表明干細胞可以促進損傷肝臟的修復、改善患者癥狀、提高患者存活率［1，2］。干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始細胞，根據(jù)其生存階段分為胚胎干細胞(embryonic stem cells)和成體干細胞 (adult stem cells)，胚胎干細胞因倫理問題應用受到限制，而成體干細胞包括造血干細胞、骨髓干細胞、神經(jīng)干細胞、肝干細胞等有很好的應用前景。骨髓干細胞主要從自體和異體骨髓中獲得，無論是在生理條件還是病理情況下，骨髓干細胞均可以分化為成熟肝細胞［3］，而且在肝臟受損傷時，骨髓干細胞更容易定植于肝臟［4］，目前研究較多的是自體骨髓干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞 (Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)［5，6］，國內(nèi)外學者在干細胞標記、分離、培養(yǎng)及移植等方面做了大量的研究工作。干細胞移植能夠幫助患者度過危險期、等待損傷肝臟的再生，在終末期肝病治療中具有明顯的優(yōu)勢。

DMN大鼠肝硬化形成過程中存在肝臟卵圓細胞的動態(tài)變化，即細胞的數(shù)量隨著肝纖維化程度的不斷加重而增加;在停止DMN造模兩周后，即于肝纖維化開始消減時，該細胞數(shù)量的增加更為顯著，隨著肝纖維化的消減、停止DMN造模4周后，其數(shù)量有所減少。表明肝臟卵圓細胞的此種動態(tài)變化與大鼠肝硬化的形成與消減的病理變化有關，尤其對肝纖維化的消減具有重要病理生理意義［7～11］。

黃芪湯能顯著降低肝硬化大鼠血清AST、TBil和肝組織Hyp含量;可明顯改善肝組織炎癥和纖維化程度，減少肝組織α-SMA的表達。在DMN大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中，黃芪湯可使Thy1.1標記的HOC的數(shù)量顯著增加，同時使Thy1.1與CK19共定位細胞數(shù)量顯著增加，使HOC表型和功能發(fā)生改變，促使其向生理性成熟細胞 (尤其是膽管細胞)定向分化，從而促進損傷肝臟組織的重構而恢復肝臟功能。

益氣的黃芪湯可促進已經(jīng)成型的DMN大鼠肝硬化的逆轉(zhuǎn)，其主要作用機制可能與其直接促進HOC的表達數(shù)量有關，誘導HOC向膽管上皮細胞分化，同時對HOC向肝細胞的分化有一定的抑制作用。進一步深入研究該方劑誘導HOC分化的作用機制不僅有重要的應用價值，對中醫(yī)藥基礎研究也將有重要的理論意義。

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