吳則東 ，王華忠

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱 150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

利用返回式衛(wèi)星等所能到達(dá)的空間環(huán)境對(duì)植物（種子）的誘變作用產(chǎn)生有益的變異，在地面選育植物新種質(zhì)、新材料，培育新品種的高新技術(shù)育種途徑和方法，稱為航天育種或空間誘變育種[1]。1987年，我國(guó)第9顆返回式科學(xué)試驗(yàn)衛(wèi)星攜帶著水稻和青椒種子發(fā)射成功，這是我國(guó)航天育種的開(kāi)始[2]。自此以后，我國(guó)航天育種事業(yè)蓬勃發(fā)展，截止到2010年，通過(guò)國(guó)家或省級(jí)鑒（審）定的航天誘變新品種達(dá)到60個(gè)，累計(jì)推廣240萬(wàn)公頃[3]。由于中國(guó)不是甜菜的起源國(guó)，品種資源相對(duì)匱乏，因此改善種質(zhì)資源極為重要[4]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)甜菜種子進(jìn)行航天搭載誘變處理，對(duì)SP1代變異株葉片及花蕾還原糖含量的測(cè)定以及對(duì)四倍體品系葉片表皮細(xì)胞葉綠體及花粉粒萌發(fā)孔的觀察，并與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，探討航天搭載種子的變異機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的材料均來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所經(jīng)過(guò)十余年選擇自育的國(guó)產(chǎn)優(yōu)良甜菜品系，同一甜菜品種的種子分作兩份，一份衛(wèi)星搭載，另一份留在地面做對(duì)照。2006年9月，經(jīng)“實(shí)踐八號(hào)”航天育種衛(wèi)星搭載了8份甜菜材料，經(jīng)過(guò)15d的在軌飛行返回地面。本試驗(yàn)選用其中的5份材料，其中航天品系分別命名為 HT1，HT2，HT3，HT4 和 HT5，相應(yīng)的對(duì)照分別命名為 CK1，CK2，CK3，CK4 和 CK5，其中 HT1 和 HT2 為多胚二倍體品系，HT3和HT4為單胚二倍體保持系，HT5為多胚四倍體品系，航天品系當(dāng)年與對(duì)照一起培育母根。每個(gè)航天品系選取一株變異株為供試材料，變異株的標(biāo)準(zhǔn)主要是葉形比親本明顯變窄。測(cè)定還原糖的取樣時(shí)間為2007年6月15日，主莖取生長(zhǎng)點(diǎn)附近葉片及主莖頂端未成熟花蕾，2007年7月4日取開(kāi)放花蕾，稱重并放于-80℃冰箱保存待用；觀察葉片下表皮葉綠體數(shù)取樣時(shí)間為2007年6月5日；觀察花粉粒萌發(fā)孔的取樣時(shí)間為2007年6月10日。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2007年4月17日，將航天品系及其對(duì)照分別栽植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所農(nóng)村試驗(yàn)地，株距40cm，不同品系之間相隔100m以上，每個(gè)品系種植60株。5月20日進(jìn)行施肥，常規(guī)田間管理。

1.2.2 還原糖含量的測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖[5－6]。3，5-二硝基水楊酸溶液與還原糖（各種單糖和麥芽糖）溶液烘熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和棕紅色物顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系。先利用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖測(cè)定消光度值，以消光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程。然后在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定待測(cè)樣品棕紅色物質(zhì)的消光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可求出樣品中還原糖的含量。實(shí)驗(yàn)中所用的藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純，所用的儀器為國(guó)產(chǎn)的T6型紫外分光光度計(jì)。

1.2.3 花粉粒萌發(fā)孔的觀察 利用2%醋酸地衣紅對(duì)甜菜花粉進(jìn)行染色，在顯微鏡下對(duì)花粉粒萌發(fā)孔進(jìn)行觀察，記錄花粉粒萌發(fā)孔的數(shù)目[7]。一般四倍體甜菜花粉粒萌發(fā)孔的數(shù)目大于12個(gè)，而二倍體甜菜花粉粒萌發(fā)孔的數(shù)目小于7個(gè)[8]。取樣時(shí)間為2007年6月16日，樣品為HT5及CK5。實(shí)驗(yàn)中所用的地衣紅為進(jìn)口，顯微鏡為日本產(chǎn)的OLYMPUS，型號(hào)是CHK，觀察倍數(shù)為40倍，照相機(jī)為日本索尼公司的DSC-W30型。

1.2.4 葉片下表皮葉綠體數(shù)的觀察 將甜菜葉片下表皮撕下，用1%的硝酸銀溶液進(jìn)行染色[9]，使用顯微鏡對(duì)葉綠體數(shù)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行拍照。所用顯微鏡及照相機(jī)同花粉粒萌發(fā)孔的觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 太空環(huán)境對(duì)甜菜不同品系還原糖的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看（見(jiàn)表1），衛(wèi)星搭載的兩個(gè)航天品系（HT2和HT4）在3個(gè)取樣點(diǎn)均表現(xiàn)為還原糖的含量低于對(duì)照品系，HT3則表現(xiàn)為還原糖的含量在3個(gè)取樣點(diǎn)均高于對(duì)照品系，而HT1則是葉片還原糖含量低于對(duì)照，花蕾還原糖含量均高于有對(duì)照。其中HT1未開(kāi)放花蕾還原糖的含量比對(duì)照高32%，HT2未開(kāi)放花蕾還原糖的含量比對(duì)照低22%，HT3葉片及開(kāi)放花蕾中還原糖的含量均比對(duì)照高30%；而其余航天品系與對(duì)照還原糖的含量則差異不大。從表中我們還可以看到開(kāi)放花蕾中還原糖的含量明顯高于葉片及未開(kāi)放花蕾。

表1 航天搭載和對(duì)照不同取樣部位還原糖含量的測(cè)定

圖1 CK5花粉粒萌發(fā)孔

圖2 HT5（變異株1）花粉粒萌發(fā)孔

圖3 HT5（變異株2）花粉粒萌發(fā)孔

2.2 太空環(huán)境對(duì)甜菜四倍體花粉粒萌發(fā)孔數(shù)的影響

從圖中我們可以看到，和對(duì)照相比，航天品系的花粉粒萌發(fā)孔發(fā)生了兩種變化，一種是花粉粒大小不一，而且萌發(fā)孔數(shù)目明顯變少，對(duì)照萌發(fā)孔數(shù)在16個(gè)左右，而航天品系僅有12～13個(gè)；另外一種變化是花粉粒和萌發(fā)孔增大，萌發(fā)孔數(shù)目增多，一般在16個(gè)以上。

2.3 太空環(huán)境對(duì)甜菜四倍體葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的影響

對(duì)于植物四倍體品系鑒定的方法，在未開(kāi)花之前一般都采用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法，例如煙草[10]、枇杷[11]等等，甜菜四倍體的鑒定也經(jīng)常采用此法[12]，一般認(rèn)為葉綠體數(shù)在24個(gè)以上就為四倍體，小于14個(gè)的就為二倍體。

從圖4中我們可以看出，甜菜葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)航天處理和對(duì)照之間沒(méi)有明顯的區(qū)別，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)均在24個(gè)以上。

圖4 CK5和HT5葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體

3 結(jié)論和討論

植物體內(nèi)的還原糖主要是葡萄糖、果糖和麥芽糖。它們?cè)谥参矬w內(nèi)的分布，不僅反映植物體內(nèi)碳水化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)情況，而且也是合成其它成分碳架來(lái)源和呼吸作用的基質(zhì)。研究表明，同一品系，還原糖含量的高低，和植物的抗性有一定的關(guān)系，例如馬鈴薯對(duì)軟腐病的抗性[13]、甜菜對(duì)叢根病的抗性等等[14]，都證實(shí)了還原糖含量的提高能夠增強(qiáng)品系的抗性水平。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，還原糖含量的變化在4個(gè)品系中表現(xiàn)并不一致，說(shuō)明航天誘變的方向具有不確定性，這和前人研究結(jié)果相同[15]。從花粉粒萌發(fā)孔及保衛(wèi)細(xì)胞氣孔葉綠體觀察結(jié)果表明，葉片保衛(wèi)細(xì)胞氣孔葉綠體數(shù)沒(méi)有發(fā)生改變，而航天品系有些株系的花粉粒萌發(fā)孔的數(shù)目和大小發(fā)生了改變，因此可以看出，誘變的表達(dá)主要是在生殖器官。

我國(guó)甜菜種質(zhì)資源極其匱乏，目前登記入國(guó)家種質(zhì)庫(kù)的僅有1300多份[16]，與國(guó)外相差懸殊。因此，要想提高我國(guó)甜菜的育種水平，就要首先改善現(xiàn)有的種質(zhì)資源，而航天誘變則為一個(gè)不錯(cuò)的選擇。由于航天搭載的材料具有變異率高、純合快以及產(chǎn)生可用于生產(chǎn)的特殊類型多的特點(diǎn)[17-19]。如通過(guò)對(duì)還原糖含量的提高，用來(lái)篩選抗性品系。通過(guò)幾代的自交，逐步純化。本試驗(yàn)中我們測(cè)量的生理指標(biāo)相對(duì)較少，將來(lái)可以通過(guò)對(duì)更多變異植株進(jìn)行逐代自交，并通過(guò)不同生理指標(biāo)的測(cè)定來(lái)篩選不同用途的品系，這將大大加速甜菜品系選擇的步伐，也是將來(lái)甜菜育種的一種全新選擇。

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