郭麗萍，王鳳舞，唐娟

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109）

美拉德反應(yīng)被稱為非酶褐變，是食品原料中氨基化合物（氨基酸，肽和蛋白質(zhì)）和羰基化合物（糖類）在食品加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中自然發(fā)生的反應(yīng)[1]。美拉德反應(yīng)歷程、產(chǎn)物組成及其性質(zhì)是氨基化合物和羰基化合物的種類、性質(zhì)、以及它們的反應(yīng)比例、pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間、水分活度、緩沖液濃度等多種因素共同作用的結(jié)果[2]。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性是由Franzke和Iwainsky[3]于1954年首次發(fā)現(xiàn)的，他們對(duì)加入甘氨酸－葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)物的人造奶油的氧化穩(wěn)定性進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道。直至上世紀(jì)八十年代，關(guān)于美拉德產(chǎn)物抗氧化活性研究才逐漸增多，并成為當(dāng)今食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)和食品化學(xué)的熱門課題[4]。因?yàn)槊览路磻?yīng)產(chǎn)物是食品原料在加工和貯藏中自然產(chǎn)生的物質(zhì)，所以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物被認(rèn)為是天然的具有抗氧化活性的物質(zhì)，其中某些物質(zhì)的抗氧化能力可以與食品中常用的抗氧化劑相媲美[5-7]。

本文研究了pH和加熱時(shí)間對(duì)半乳糖－L-賴氨酸美拉德反應(yīng)的影響，并對(duì)產(chǎn)物的還原能力和清除DPPH·的能力進(jìn)行了檢測(cè)，為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的應(yīng)用提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)水半乳糖；L-賴氨酸鹽酸鹽；磷酸鈉緩沖液；六亞甲基四胺緩沖液；檸檬酸；無(wú)水碳酸鈉；鐵氰化鉀；三氯乙酸；三氯化鐵；無(wú)水乙醇；DPPH·；雙氧水；紫尿酸胺（TMM）指示劑；超純水等。

1.2 儀器與設(shè)備

YY－1恒溫油浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；GT－8渦輪振蕩器：寧波飛馳科技有限公司；UV－2100PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；F－2500型熒光分光光度計(jì)：日本日立公司；ETTLer AE100電子天平：上海天達(dá)儀器有限公司；PHS－3C精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；KQ－500B型超聲波清洗器：昆侖市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

室溫下，配制等摩爾濃度的半乳糖－L－賴氨酸溶液：濃度為0.03 mol/mL的半乳糖和0.03 mol/mL的賴氨酸鹽酸鹽等體積于100 mL乳鹽（乳清的超濾滲透物在一定濃度、溫度、pH條件下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間沉淀，便得到了乳鹽，主要成分是磷酸鈣。）溶液，磁力攪拌至晶體全部溶解。將溶液均分為3份，分別用檸檬酸和無(wú)水碳酸鈉調(diào)節(jié)其pH為5、7和9；取約7 mL各pH樣品分裝至10 mL安培瓶中，充氮?dú)? min，酒精噴燈封口。將封口后的安培瓶至于120℃的恒溫油浴鍋，加熱并不斷振蕩，至預(yù)訂時(shí)間（5 min，10 min，15 min，20 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h 和 12 h），取出樣品，并放于冰水浴中快速冷卻。待樣品制備完全并平衡至室溫，測(cè)定pH。

1.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的光譜行為分析

1.3.2.1 樣品的紫外－可見(jiàn)光（UV－Vis）掃描

將pH5和pH7的所有樣品用超純水進(jìn)行100倍稀釋（體積比），pH9樣品為200倍稀釋。利用UNICOPC－2012型分光光度計(jì)將稀釋后的樣品進(jìn)行198 nm～501 nm的掃描，以未加熱樣品為對(duì)照，建立基線，記錄特定波長(zhǎng)下的光密度用于分析美拉德反應(yīng)進(jìn)度及產(chǎn)物形成情況。

1.3.2.2 樣品的熒光分光光度測(cè)定

利用日立F－2500型熒光分光光度計(jì)測(cè)定347 nm波長(zhǎng)激發(fā)下樣品的350 nm～550 nm的發(fā)射光譜，記錄最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，用以分析美拉德反應(yīng)進(jìn)程及熒光性中間產(chǎn)物的產(chǎn)生與積累。

1.3.3 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.3.1 還原能力的測(cè)定[8]

取1 mL 1.3.1中稀釋后的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物于5 mL離心管中，加入1 mL的磷酸鈉緩沖液 （0.2 mol/mL，pH6.6）和鐵氰化鉀（1 mL，1%）。利用渦輪振蕩器將混合液振蕩均勻后，將離心管至于50℃的恒溫水浴中，水浴20 min后取出，加入1 mL、10%的三氯乙酸，振蕩均勻。取此混合液1 mL于干燥的5 mL離心管中，加入1 mL水和0.2 mL、0.1%三氯化鐵，迅速混勻。室溫下靜置10 min后，以未加熱樣品為對(duì)照，調(diào)零，測(cè)定700 nm下的吸光值，此吸光值的大小反應(yīng)了樣品還原能力。

1.3.3.2 DPPH·清除能力的測(cè)定[9－10]

取0.4 mL 1.3.1中稀釋后的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物于5 mL離心管中，加入2 mL、0.1 mol/L的DPPH·無(wú)水乙醇溶液混勻，室溫下于暗處放置30 min，放置過(guò)程中不斷振蕩；以未加熱樣品為對(duì)照，同條件下無(wú)水乙醇與未加熱樣品的混合物調(diào)零，30 min后測(cè)定反應(yīng)混合液517 nm下的吸光值。因?yàn)槊览路磻?yīng)產(chǎn)物在517 nm下有光吸收，所以同時(shí)準(zhǔn)備樣品空白，進(jìn)行測(cè)定結(jié)果修正。

2 結(jié)果與分析

2.1 體系pH測(cè)定結(jié)果及分析

2.1.1 pH5體系pH測(cè)定結(jié)果

室溫下在不同的加熱時(shí)間段內(nèi)，pH變化強(qiáng)度不同，如圖1所示。

在最初的60 min加熱時(shí)間內(nèi)，樣品pH下降了0.8個(gè)單位，但是在隨后的660 min內(nèi)，pH也是下降了0.8個(gè)單位。

2.1.2 pH7體系pH測(cè)定結(jié)果

pH7樣品隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，pH也出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。而且在不同的加熱時(shí)間段內(nèi)，pH變化強(qiáng)度不同。pH隨時(shí)間變化曲線見(jiàn)圖2。

如圖2所示，在最初的60 min加熱內(nèi)，樣品pH下降了2.8個(gè)單位，但是在隨后的660 min內(nèi)，pH僅僅下降了0.8個(gè)單位。

2.1.3 pH9體系pH測(cè)定結(jié)果

任何初始pH條件下，美拉德反應(yīng)進(jìn)入高級(jí)階段后都會(huì)經(jīng)歷降解反應(yīng)，所以隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行都會(huì)有小分子的有機(jī)酸積累，從而體系pH降低，結(jié)果見(jiàn)圖3。

如圖3所示，在初始pH為9的體系中，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品pH也是逐漸降低的，而且不同加熱時(shí)間內(nèi)，降低強(qiáng)度不同。在最初的60 min加熱內(nèi)，樣品pH下降了3.6個(gè)單位，在隨后的660 min內(nèi)，pH下降了1.1個(gè)單位。

2.1.4 體系pH變化分析

對(duì)于3個(gè)pH不同樣品來(lái)講，在反應(yīng)初始的一段時(shí)間內(nèi)，pH下降速度較快，而且與時(shí)間存在較好的線性關(guān)系；但是隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，pH下降趨于緩慢，且與時(shí)間的線性關(guān)系很差，說(shuō)明羰－氨在熱處理比較溫和的條件下（加熱時(shí)間不長(zhǎng)），參與反應(yīng)的物質(zhì)較少，反應(yīng)途徑比較簡(jiǎn)單，降解產(chǎn)物如甲酸和乙酸等進(jìn)行簡(jiǎn)單的積累，致使體系pH可以與反應(yīng)進(jìn)程呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如表1所示。

但是，隨著處理?xiàng)l件的加?。訜釙r(shí)間持續(xù)延長(zhǎng)），美拉德反應(yīng)進(jìn)入終級(jí)階段，中間產(chǎn)物作為反應(yīng)物參與到高級(jí)與終級(jí)階段的降解、縮合、聚合、環(huán)化合等反應(yīng)中；還有研究表明，Amadori產(chǎn)物和它們的二羰基降解產(chǎn)物在相對(duì)較高的pH下易于降解，產(chǎn)生低分子有機(jī)酸，所以體系在開(kāi)始的時(shí)間內(nèi)pH下降較快，而且在相同的pH環(huán)境中，pH變化相同。比較3個(gè)pH樣品變化關(guān)系，相同時(shí)間內(nèi)pH9樣品變化最大。表明，美拉德反應(yīng)速率隨pH的增加而增加，已有大量研究證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)[11]。

表1 不同加熱時(shí)間段內(nèi)pH變化與時(shí)間的線性關(guān)系Table 1 The linear relationship of pH and time in different heating period

2.2 體系光度行為分析

2.2.1 體系的紫外－可見(jiàn)分光光度掃描結(jié)果

以各pH模型加熱8 h的樣品為例，研究各個(gè)模型體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的光度行為，如圖4所示。從掃描結(jié)果可以看出，半乳糖－賴氨酸模型體系加熱后，都在294 nm處產(chǎn)生了明顯的光吸收，而且210 nm處也有較強(qiáng)的吸收峰，但是對(duì)于可見(jiàn)光波段處的光吸收，模型體系的表現(xiàn)非常不同。pH5和pH7模型在360 nm處有吸收峰，在400 nm～470 nm之間沒(méi)有較強(qiáng)的光吸收；pH9模型在360 nm～470 nm之間沒(méi)有吸收峰，物質(zhì)的可見(jiàn)光吸收是物質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有發(fā)色團(tuán)，能夠吸收特定波長(zhǎng)下的光能量，所以，反應(yīng)介質(zhì)的初始pH能夠影響終級(jí)產(chǎn)物－類黑素的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)。

2.2.2 樣品熒光測(cè)定結(jié)果

研究表明，美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生具有熒光性的物質(zhì)，且反應(yīng)產(chǎn)生的熒光性先于褐色聚合物，所以認(rèn)為熒光性是反應(yīng)中產(chǎn)生的小分子中間體所具有的，從而用樣品在一定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度的變化來(lái)表征另一類美拉德反應(yīng)小分子中間體的產(chǎn)生速率和積累情況[12－13]，這類小分子中間體與210 nm和294 nm吸光值所指示的無(wú)色小分子中間體不同，被稱為熒光中間體。3模型體系在EX/EM為347/415波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度隨加熱時(shí)間的變化如圖5所示。

從圖5中可以看出，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生熒光沒(méi)有誘導(dǎo)期，與同體系的紫外－可見(jiàn)光吸收相比，在加熱開(kāi)始的時(shí)間內(nèi)，隨時(shí)間變化較為劇烈，表明熒光中間體更易于產(chǎn)生。各模型體系中熒光強(qiáng)度在加熱一段時(shí)間后都達(dá)到了最大值，然后降低，表明熒光中間體比無(wú)色中間體更易于參與到美拉德反應(yīng)的終級(jí)階段，生成褐色聚合物。但是，三模型體系熒光強(qiáng)度到達(dá)最大值的時(shí)間不同，pH9體系在加熱30 min后就達(dá)到了最大值，而pH5和pH7體系分別加熱180 min和120 min后才達(dá)到最大值。這也表明隨pH增加，美拉德反應(yīng)速率增大。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化結(jié)果及分析

2.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原能力測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果如圖6所示。

對(duì)于初始pH5和pH7的模型體系，其產(chǎn)物的抗氧化能力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增強(qiáng)，且在60 min時(shí)間內(nèi)增長(zhǎng)速度較快。但是，pH9模型體系中產(chǎn)物的還原能力隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)了極不規(guī)律的變化，即在加熱15 min時(shí)達(dá)到了一個(gè)較大值，然后降低，后又逐漸增大，在加熱120min到180min之間出現(xiàn)最大值，然后產(chǎn)物還原能力表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。就組間比較而言，pH5和pH7樣品還原能力相差不多，此兩模型的產(chǎn)物在較低濃度下（還原能力測(cè)試濃度1.089 mg/mL）表現(xiàn)出較好的還原能力；pH9樣品還原能力很強(qiáng)，在非常低的濃度下（樣品測(cè)試濃度為0.544 5 mg/mL）表現(xiàn)出了很強(qiáng)的還原能力。但是500 min后，pH9的樣品還原能力有所下降，可能是美拉德反應(yīng)中間體——還原酮類物質(zhì)及類化合物生成，這些產(chǎn)物也具有抗氧化等活性[14]。

2.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH·清除能力測(cè)定結(jié)果

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物自由基清除能力是通過(guò)其對(duì)DPPH·的清除能力來(lái)表征的，3個(gè)模型體系的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物均表現(xiàn)了較強(qiáng)的自由基清除能力。pH5和pH7體系中產(chǎn)物的自由基清除能力隨時(shí)間而不斷增加；pH9體系加熱60 min后的產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除能力就已達(dá)到87%，隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)物的自由基清除能力基本不變。組間產(chǎn)物的自由基清除能力比較可以看出，pH9體系產(chǎn)物的自由基清除能力非常強(qiáng)，在0.5445mg/mL的測(cè)試濃度下，清除能力最高為92.07%。

從圖6和圖7可以看出，3個(gè)體系在加熱6 h后，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力趨向一致，甚至pH5和pH7樣品要強(qiáng)于pH9，從這一方面來(lái)講，褐色聚合物的大量積累不一定能夠表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，但是很多研究認(rèn)為類黑素類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有抗氧化作用的主要成分。這需要進(jìn)一步研究半乳糖－賴氨酸美拉德反應(yīng)類黑素類物質(zhì)的抗氧化作用。

3 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，美拉德反應(yīng)在堿性環(huán)境中反應(yīng)速率較快，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)色中間體和熒光中間體都參與到美拉德反應(yīng)的終級(jí)階段，生成褐色聚合物，且熒光中間體參與到終級(jí)階段的反應(yīng)速度更快。

美拉德反應(yīng)在堿性環(huán)境中不但反應(yīng)速率較快，在反應(yīng)初期反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性也明顯強(qiáng)于酸性和中性環(huán)境；加熱600 min后，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力趨向一致，甚至pH5和pH7樣品要強(qiáng)于pH9。但是pH9模型中美拉德反應(yīng)最終產(chǎn)物－類黑素類物質(zhì)生成量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pH5和pH7，從這一方面來(lái)講，褐色聚合物的大量積累不一定能夠表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，但是很多研究認(rèn)為類黑素類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有抗氧化作用的主要成分。所以這需要進(jìn)一步研究半乳糖－賴氨酸美拉德反應(yīng)類黑素類物質(zhì)的抗氧化作用，而這也是研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的難點(diǎn)所在。

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