王丹

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春 130118；2.長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林長春 130031）

近年來很多學者對大豆異黃酮開展了廣泛而深入的研究，研究結果表明：大豆異黃酮是一類重要的生理活性物質，具有較強的生理功能，具有弱雌激素、抗氧化、抗溶血等活性，能夠有效地預防和抑制骨質酥松、癌癥和婦女更年期綜合癥等疾病的發(fā)生[1－2]；迄今為止，已知大豆異黃酮共有12種異構體，分為游離型的苷元和結合型的糖苷2類，其中苷元占總量的2%～3%，糖苷占總量的97%～98%。但天然糖苷類的分子結構并不是活性的最佳狀態(tài)，具有生理活性的成分主要是大豆異黃酮苷元[3－4]；21世紀以來獲得大豆異黃酮苷元的方法主要是酸解法和酶解法，但人們對酸解法得到的大豆異黃酮苷元的穩(wěn)定性有所懷疑，二酶法由于具有反應條件溫和，得到的大豆異黃酮苷元不易變形等優(yōu)點，成為制備大豆異黃酮苷元的最佳途徑。

迄今國內(nèi)外對高產(chǎn)活性大豆異黃酮糖苷水解酶的研究正處于研制階段，工業(yè)化生產(chǎn)還較為罕見[5]。本文試圖探討利用一株通過誘變得到的黑曲霉產(chǎn)大豆異黃酮糖苷酶產(chǎn)生菌，對其產(chǎn)酶的發(fā)酵工藝條件進行了研究，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉誘變株：再生資源利用吉林農(nóng)業(yè)大學食品生化與功能性食品實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁100 mL，蔗糖1.5 g，pH自然。

產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基：麩皮 2.0 g，（NH4）2SO41.5 g，KH2PO40.05 g，水100 mL，pH自然。

1.1.3 主要試劑及儀器設備

水楊素：Sigma公司；其它試劑為分析純。723分光光度計：上海棱光技術有限公司；PDX－650B恒溫電熱培養(yǎng)箱：沈陽市醫(yī)療器械研究所；SHZ－82A國華水浴恒溫振蕩器：中科院武漢科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)

將菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)72 h。

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

將一定量的無菌水倒入斜面培養(yǎng)的菌液試管中刮洗，制得孢子懸液。將其定量加入到產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。經(jīng)過濾制得粗酶液，測定酶活力。

1.2.3 酶活力的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

分別取 0.1%標準葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 于 50 mL 的編號為 1 號～11號得比色管中。向每支比色管中加入蒸餾水至2.0mL；再分別加入 2.0 mL DNS（3，5－二硝基水楊酸），沸水浴中顯色5 min；迅速冷卻后加蒸餾水定容至50 mL，用723分光光度計于波長510 nm處測定吸光度值。以葡萄糖量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3.2 大豆異黃酮糖苷酶活的測定

取經(jīng)適當稀釋的酶液0.1 mL，1%水楊素溶液（用pH4.6、0.1 mol/L醋酸緩沖液配制）0.9 mL，于50℃下保溫30 min。用DNS法在510 nm處測定還原糖（以葡萄糖計），以滅活（100℃，10 min）的酶液作對照。

2 結果與分析

2.1 碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

以產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基為基礎，改變其中碳源的種類進行產(chǎn)酶實驗，結果見圖1。

圖1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.1 The effection of different carbon sources on enzyme production of strain

從圖1可以表明該菌株可以利用玉米芯和麩皮作為碳源，而且以4%麩皮和2%玉米芯的復合碳源為培養(yǎng)基的產(chǎn)酶活性最好。利用玉米芯和麩皮這些農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的廢棄物作為碳源對于該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)大幅度降低成本具有一定的現(xiàn)實意義。

2.2 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

選擇不同的氮源替代產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基中的（NH4）2SO4進行試驗，結果見圖 2。

圖2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.2 The effection of different nitrogen sources on enzyme production of bacteria

從圖2可以看出，以豆餅粉和NH4Cl作為復合氮源時產(chǎn)酶活力最高。無機氮源的添加可以提高產(chǎn)酶，但當無機氮源添加量超過2%時對產(chǎn)酶不利。

2.3 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

分別以 6%、8%、10%、12%、14%的接種量在250 mL的錐形瓶中進行搖瓶實驗，測定酶活力，結果見圖3。

從圖3可知，當接種量為10%時酶活力最高，接種量增加或減少，酶活力都會有不同程度地降低。

2.4 培養(yǎng)基起始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基的pH會影響細胞表面帶電基團的解離及其微觀結構，從而影響營養(yǎng)物質的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，導致微生物的生長和代謝發(fā)生改變。因此，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0進行產(chǎn)酶實驗，結果見圖4。

由圖4可知，培養(yǎng)基起始pH為6.0較適合菌株的產(chǎn)酶。

2.5 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

將孢子懸浮液定量接入產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后開始測定酶活力，每隔12小時測定一次，直至96 h，結果見圖 5。

表2 正交試驗方案及結果Table 2 Orthogonal experimental program and results

從圖5可知，培養(yǎng)36 h開始產(chǎn)酶，當培養(yǎng)72 h時產(chǎn)酶基本達到最高值。

2.6 不同因素對產(chǎn)酶的影響

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗，研究研究氮源、碳源、接種量和KH2PO4這4個因素對菌株產(chǎn)酶的影響，因素水平見表1。

表1L9（34）正交試驗的因素和水平Table 1L9（34）orthogonal test factors and levels

通過極差分析方法可知，如表2所示，各因素對菌株產(chǎn)酶的影響的大小順序為：氮源（B）＞KH2PO4添加量（D）＞碳源（A）＞接種量（C），正交結果顯示，最優(yōu)工藝組合為A2B2C3D3，經(jīng)實驗驗證，此組合被確定為最佳工藝，即最佳產(chǎn)酶條件為：以麩皮和玉米芯為碳源，豆餅粉和NH4Cl為混合氮源，添加0.1%KH2PO4制備成pH為6.0培養(yǎng)基，接種量為10%，置于28℃的培養(yǎng)溫度，200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，可獲得較高的產(chǎn)酶活性，可達 2.463×1010kat/mL。

3 結論與討論

通過對利用野生型黑曲霉誘變菌株發(fā)酵生產(chǎn)大豆異黃酮糖苷酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化的研究，初步確定培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基組分為麩皮4%、玉米芯2%、黃豆粉 2%、NH4Cl 2%、KH2PO40.1%，pH 為 6.0，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為28℃，72 h的條件下培養(yǎng)可獲得較高的產(chǎn)酶活性，可達2.463×1010kat/mL。

該菌株可利用玉米芯、豆餅粉等工業(yè)生產(chǎn)的廢棄料作為營養(yǎng)基質產(chǎn)生大豆異黃酮糖苷酶，有利于采用微生物法制備異黃酮苷元的工業(yè)產(chǎn)業(yè)化的推廣，有一定的參考價值。

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[1]Adlercreutz H.Phytoestrogens:epidermiology and a possible role in cancer protection[J].Environ health perspect,1995,103(7):103－112

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[3]井樂剛,張永忠.微生物發(fā)酵制備大豆異黃酮的研究進展[J].微生物學通報,2003,30(2):86－88

[4]唐傳核,彭志英.大豆蛋白水解物的苦肽以及脫除方法進展[J].中國油脂,2000,25(4):44－47

[5]孫艷梅,張永忠.水解制備大豆異黃酮甙元研究進展[J].食品研究與開發(fā),2002,23(3):11－13